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洁净度（沉降菌）的检验标准操作规程
洁净度（沉降菌）的检验标准操作规程
1 目的
建立洁净度（沉降菌）的检验标准操作规程，为沉降菌检查人员提供正确的标准操作方法。
2 范围
适用于本公司洁净度（沉降菌）检查的全过程。
3 责任
QA对本规程的有效执行承担监督检查责任，QC对本规程的实施负责。
4 程序
4.1概述：本标准对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。其建筑结构、装备及其使用均具有减少对该区域内污染源的介入、产生和滞留的功能。
4.2测试方法
4.2.1方法提要：
本标准按国家技术监督局发布的《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》，采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
4.2.2仪器
仪器包括：培养皿、培养基、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器。
4.2.2.1培养皿
一般采用f90mm×15mm规格的培养皿。
4.2.2.2培养基
大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）或用户认可并经验证了的培养基。
4.3测试前的规则：
4.3.1测试状态；
4.3.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（无特殊要求时，温度在18℃～26℃，相对湿度在45%～65%之间为宜），同时应满足测试仪器的使用范围。
4.3.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。
4.3.1.3测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。
4.3.1.4静态测试时，培养皿暴露时间为30min以上；动态测试时，培养皿暴露时间为不大于4h。
4.3.2测试人员：
4.3.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。
4.3.2.2静态测试时，室内测试人员不得多于2人。
4.3.3测试时间：
4.3.3.1对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正
常运行不少于10min后开始。
4.3.3.2对非单向流，如B级、B级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。
4.3.4注意事项：
4.3.4.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
4.3.4.2采取一切措施防止人为对样本的污染。
4.3.4.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4.3.4.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
4.3.4.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
4.3.4.6对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室（区），采样口向上。
4.3.4.7布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口；采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。
4.3.4.8培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行对照试验，每次或每个区域取1个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿（TSA或SDA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。
4.4测试步骤：
4.4.1采样方法：
4.4.1.1仪器和用具：培养皿。
4.4.1.2方法：
a采样点一般在离地面0.8m高度的水平面上均匀布置。
b采样点多于5点时，也可以在离地面0.8m～1.5m高度的区域内分层布置，但每层不少于5点。
c打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。
最少采样点数目
|
面 积 （m2） |
洁 净 度 级 别 |
面 积 （m2） |
洁 净 度 级 别 |
||||
|
A |
B |
B |
A |
B |
B |
||
|
＜10 |
2～3 |
2 |
2 |
≥200～＜400 |
80 |
20 |
6 |
|
≥10～＜20 |
4 |
2 |
2 |
≥400～＜1000 |
160 |
40 |
13 |
|
≥20～＜40 |
8 |
2 |
2 |
≥1000～＜2000 |
400 |
100 |
32 |
|
≥40～＜100 |
16 |
4 |
2 |
2000 |
800 |
200 |
63 |
|
≥100～＜200 |
40 |
10 |
3 |
|
|
|
|
|
注：表中的面积，对于单向流洁净室，是指送风口面积。对于非单向流洁净室是指房间的面积。 |
|||||||
最少培养皿数
|
洁净度级别 |
所需φ90mm培养皿数（沉降0.5h计） |
|
A |
14 |
|
B |
2 |
|
C |
2 |
|
D |
2 |
4.4.2培养：
4.4.2.1仪器和用具：培养箱、天平（万分之一）、称量纸、锥形瓶（1000ml、150ml）、量筒（1000ml）、高压蒸汽灭菌锅。
4.4.2.2培养基：
4.4.2.2.1大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）：
a） 成分：酪蛋白胰酶消化物 15g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g 氯化钠 5g 琼脂 15g 纯化水 1000ml
b） 制法：取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷却至约60℃，在无菌操作要求下倾注约20ml至无菌平皿（f90mm）中。加盖后在室温放至凝固。
4.4.2.2.2沙氏培养基（SDA）：
a）葡萄糖 40g 酪蛋白胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物等量混合 10g 琼脂 15g 纯化水 1000ml
b）制法：取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值使灭菌后为5.6±0.2，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷却至约60℃，在无菌操作要求下倾注约20ml至无菌平皿（f90mm）中。加盖后在室温放至凝固。
4.4.2.3方法：全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养，采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿在30～35℃培养箱中培养，时间不少于2天；采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿在20～25℃培养箱中培养，时间不少于5天。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。
4.4.3菌落计数：
4.4.3.1用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
4.4.3.2若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。
4.4.4结果计算：
4.4.4.1用计数方法得出各个培养皿的菌落数。
4.4.4.2平均菌落数的计算，见式。
M1+M2+…+Mn
平均菌落数M=
n
式中 M—平均菌落数；
M1—1号培养皿菌落数；
M2—2号培养皿菌落数；
Mn—n号培养皿菌落数；
n—培养皿总数。
4.4.5结果评定：
用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物。
4.4.5.1洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。
4.4.5.2在静态测试时，若某洁净室（区）内的沉降菌平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
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