洁净度(沉降菌)的检验标准操作规程

文章来源:http://www.iwuchen.com/  2012年09月04日  点击数:5309

洁净度(沉降菌)的检验标准操作规程

1 目的

   建立洁净度(沉降菌)的检验标准操作规程,为沉降菌检查人员提供正确的标准操作方法。

2 范围

适用于本公司洁净度(沉降菌)检查的全过程。

3 责任

QA对本规程的有效执行承担监督检查责任,QC对本规程的实施负责。

4 程序

4.1概述:本标准对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。其建筑结构、装备及其使用均具有减少对该区域内污染源的介入、产生和滞留的功能。

4.2测试方法

4.2.1方法提要:

     本标准按国家技术监督局发布的《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》,采用沉降法,即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿,经若干时间,在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数,以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数,并以此来评定洁净室(区)的洁净度。

4.2.2仪器

     仪器包括:培养皿、培养基、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器。

4.2.2.1培养皿

       一般采用f90mm×15mm规格的培养皿。

4.2.2.2培养基

       大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)或沙氏培养基(SDA)或用户认可并经验证了的培养基。

4.3测试前的规则:

4.3.1测试状态;

4.3.1.1沉降菌测试前,被测试洁净室(区)的温湿度须达到规定的要求,静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。洁净室(区)的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应(无特殊要求时,温度在18℃~26℃,相对湿度在45%~65%之间为宜),同时应满足测试仪器的使用范围。

4.3.1.2沉降菌测试前,被测试洁净室(区)已经过消毒。

4.3.1.3测试状态有静态和动态两种,测试状态的选择必须符合生产的要求,并在报告中注明测试状态。

4.3.1.4静态测试时,培养皿暴露时间为30min以上;动态测试时,培养皿暴露时间为不大于4h。

4.3.2测试人员:

4.3.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。

4.3.2.2静态测试时,室内测试人员不得多于2人。

4.3.3测试时间:

4.3.3.1对单向流,如100级净化房间及层流工作台,测试应在净化空调系统正

常运行不少于10min后开始。

4.3.3.2对非单向流,如B级、B级以上的净化房间,测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。

4.3.4注意事项:

4.3.4.1测试用具要作灭菌处理,以确保测试的可靠性、正确性。

4.3.4.2采取一切措施防止人为对样本的污染。

4.3.4.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。

4.3.4.4由于细菌种类繁多,差别甚大,计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察,不要漏计培养皿边缘生长的菌落,并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别,必要时用显微镜鉴别。

4.3.4.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量,如发现变质、破损或污染的应剔除。

4.3.4.6对于单向流洁净室(区)或送风口,采样器采样口朝向应正对气流方向;对于非单向流洁净室(区),采样口向上。

4.3.4.7布置采样点时,至少应尽量避开尘粒较集中的回风口;采样时,测试人员应站在采样口的下风侧,并尽量少走动。

4.3.4.8培养皿在用于检测时,为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响,宜同时进行对照试验,每次或每个区域取1个对照皿,与采样皿同法操作但不需暴露采样,然后与采样后的培养皿(TSA或SDA)一起放入培养箱内培养,结果应无菌落生长。

4.4测试步骤:

4.4.1采样方法:

4.4.1.1仪器和用具:培养皿。

4.4.1.2方法:

a采样点一般在离地面0.8m高度的水平面上均匀布置。

b采样点多于5点时,也可以在离地面0.8m~1.5m高度的区域内分层布置,但每层不少于5点。

c打开培养皿盖,使培养基表面暴露0.5h,再将培养皿盖盖上后倒置。

                            最少采样点数目

面  积

(m2)

洁 净 度 级 别

面   积

(m2)

洁 净 度 级 别

A

B

B

A

B

B

<10

2~3

2

2

≥200~<400

80

20

6

≥10~<20

4

2

2

≥400~<1000

160

40

13

≥20~<40

8

2

2

≥1000~<2000

400

100

32

≥40~<100

16

4

2

2000

800

200

63

≥100~<200

40

10

3





注:表中的面积,对于单向流洁净室,是指送风口面积。对于非单向流洁净室是指房间的面积。

最少培养皿数

洁净度级别

所需φ90mm培养皿数(沉降0.5h计)

A

14

B

2

C

2

D

2

4.4.2培养:

4.4.2.1仪器和用具:培养箱、天平(万分之一)、称量纸、锥形瓶(1000ml、150ml)、量筒(1000ml)、高压蒸汽灭菌锅。

4.4.2.2培养基:

4.4.2.2.1大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA):

a) 成分:酪蛋白胰酶消化物 15g    大豆粉木瓜蛋白酶消化物  5g    氯化钠  5g    琼脂  15g    纯化水   1000ml

b) 制法:取上述成分除琼脂,混合,微热溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.2,加入琼脂,加热溶化后,分装,灭菌,冷却至约60℃,在无菌操作要求下倾注约20ml至无菌平皿(f90mm)中。加盖后在室温放至凝固。

4.4.2.2.2沙氏培养基(SDA):

     a)葡萄糖   40g    酪蛋白胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物等量混合  10g     琼脂  15g      纯化水   1000ml

b)制法:取上述成分除琼脂,混合,微热溶解,调节pH值使灭菌后为5.6±0.2,加入琼脂,加热溶化后,分装,灭菌,冷却至约60℃,在无菌操作要求下倾注约20ml至无菌平皿(f90mm)中。加盖后在室温放至凝固。

4.4.2.3方法:全部采样结束后,将培养皿倒置于恒温培养箱中培养,采用大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)配制的培养皿在30~35℃培养箱中培养,时间不少于2天;采用沙氏培养基(SDA)配制的培养皿在20~25℃培养箱中培养,时间不少于5天。每批培养基应有对照试验,检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。

4.4.3菌落计数:

4.4.3.1用肉眼直接计数,标记或在菌落计数器上点计,然后用5~10倍放大镜检查,有否遗漏。

4.4.3.2若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠,可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。

4.4.4结果计算:

4.4.4.1用计数方法得出各个培养皿的菌落数。

4.4.4.2平均菌落数的计算,见式。

                             M1+M2+…+Mn   

平均菌落数M=   

                                 n

式中 M—平均菌落数;

               M1—1号培养皿菌落数;

               M2—2号培养皿菌落数;

               Mn—n号培养皿菌落数;

               n—培养皿总数。

4.4.5结果评定:

     用平均菌落数判断洁净室(区)空气中的微生物。

4.4.5.1洁净室(区)内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。

4.4.5.2在静态测试时,若某洁净室(区)内的沉降菌平均菌落数超过评定标准,则必须对此区域先进行消毒,然后重新采样两次,测试结果均须合格。

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