中国药品检验标准操作规程2010版-微生物限度检查法全文

文章来源:http://www.iwuchen.com/  2012年08月30日  点击数:13646

中国药品检验标准操作规程2010版-微生物限度检查法全文


一、细菌、霉菌和酵母菌计数

1 简述

细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是用于评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据。

细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法,这是活菌计数的方法之一,也是目前国际上许多国家常用的一种方法。以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在该规定条件下所生长的细菌(为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。

一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数,实际为菌落形成单位数(colony forming unity,cfu),不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。

2 设备、仪器

2.1 设备

2.1.1 洁净实验室

微生物限度检查应有单独的洁净实验室,每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。

2.1.1.1 结构和要求 洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。操作间与缓冲间之间应有样品传递舱,出入操作间和缓冲间的门不应直对。洁净实验室内应六面光滑平整,能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形,无缝隙,不留死角。操作间内不应安装下水道。

洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内,室内光照应分布均匀,光照度不低于300LX。

2.1.1.2 温度、湿度 洁净实验室内的温度应控制在18~26℃,相对湿度最好在40%~60%。

2.1.1.3 操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于10000级,局部洁净度为100级(或放置同等级净化工作台)。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压,不低于10Pa,操作间与缓冲间也应保持相对正压,不低于5Pa。操作台上备有药物天平,乙醇灯,火柴,乙醇棉球,大、小橡皮乳头等。

2.1.1.4 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆和无菌衣、帽、口罩、鞋套等。

2.1.1.5 洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法(参照《医药工业洁净室》(区)悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准)进行洁净度验证。

不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准见下表1。



表l 不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准

洁净级别

尘埃数ㄍm3

浮游菌(个)ㄍm3

沉降菌(个)ㄍ

(φ90mm?0.5h)

微粒直径≥0.5μm

微粒直径≥5μm

100级

≤3,500

≤0

≤5

≤1

10000级

≤350,000

≤2000

≤100

≤3

100000级

≤3,500,000

≤20,000

≤500

≤10


沉降菌数测定(Ⅱ法)

洁净实验室操作台消毒擦拭处理后,先启动层流净化装置30min,将备妥的营养琼脂平板3个(经30~35℃预培养48h,证明无菌落生长)。以无菌方式(或经传递箱)移人操作间,置净化台左、中、右各1个,开盖,暴露30min后将盖盖上。在30~35℃培养箱内倒置培养48h,取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。

有条件的单位,同时应检查洁净操作间和净化工作台上的浮游菌和微粒数。

操作问和净化工作台要定期检测其洁净度,分别应达到10000级和100级。如菌落数或微粒数超标,应清洗过滤系统中的过滤设施,必要时予以更换。

2.1.1.6 在每次操作前、后用0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角,然后启动层流净化装置。

2.1.2 阳性菌实验室

涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等实验活动,应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外,阳性菌实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准,阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。

2.1.3 洁净实验室、阳性菌实验室与洗刷、灭菌、消毒、培养及结果观察的工作间等设施应相对集中,布局合理,避免污染,便于管理。

2.2 仪器

2.2.1 恒温培养箱(30~35℃)、生化培养箱(23~28℃)、微波炉、匀浆仪(3000~8000 r/min)或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱(100~300℃)、电冰箱、离心机、离心管、微孔滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器(使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定)。

菌落计数器、显微镜(40×~1500×)、电子天平或药物天平(感量0.1g),pH计。

2.2.2 玻璃器皿 锥形瓶(250~300ml、500ml内装玻璃珠若干)、培养皿(9cm)、量筒(100ml,500m1)、试管(18mm×180mm)及塞、吸管(1m1分度0.0l,10m1分度0.1)、注射器(20ml或30m1)、涂布棒、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)、不锈钢桶(带盖)。玻璃器皿用前应洗涤干净,吸管、量筒不挂水滴,无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花,置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞,若用振荡器制备混悬液时,尚需用玻璃纸包裹瓶塞,以免振荡时供试液污染瓶塞,再用牛皮纸包扎。玻璃器皿,均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min,烘干备用。

2.2.3 用具 大、小橡皮乳头(放于干净带盖的容器中,并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡)。无菌衣、帽、口罩、手套(洗净后配套,用牛皮纸包严)灭菌,备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。

接种环(白铱金或镍铬合金,环径4~5mm、长度6~10cm)、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖(12cm)、实验记录纸等。

3 试液、稀释剂和试剂

3.1试液

3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液(供洗手、擦拭操作台面用)。

3.1.2 5%石碳酸溶液(配好后装入玻璃消毒缸内,供消毒带菌吸管用)亦可选用其他适宜消毒液。

3.1.3 75%乙醇溶液。

3.1.4 碘酊或碘伏溶液。

3.2 稀释剂和试剂

稀释剂配制后,采用高压蒸汽灭菌法灭菌。

3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液(附件二3.1)。

3.2.2 pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液(附件二3.5)。

3.2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠?蛋白胨缓冲液(附件二3.4)。

3.2.4 pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(附件二3.3)。

3.2.5 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液(附件二3.2)。

3.2.6 无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液(TTC)(附件二2.15)。

3.2.7 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液(附件二3.3)。

4 培养基

4.1 营养琼脂培养基(附件二5.2)。

4.2 玫瑰红钠琼脂培养基(附件二5.4)。

4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基(附件二5.5)。

培养基制备注意事项:

4.3.1 采用干燥培养基,按说明配制,应对灭菌后的培养基pH进行校验。若为自配培养基,原料应挑选,琼脂凝固力应测定,以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。

4.3.2 配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀,应于溶化后趁热过滤,灭菌后使用。

4.3.3 培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。包装时,塞子必须塞紧,以免松动或脱落造成染菌。

4.3.4 培养基配制后应在2h内灭菌,避免细菌繁殖。

4.3.5 灭菌后的培养基应保存在2~25℃,防止被污染,可在3周内用毕;保存于密闭容器中,可在1年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长,以免水分散失及染菌。

4.3.6 宜采用用水浴或微波炉加热熔化琼脂培养基,勿用电炉直接熔化琼脂培养基,以免营养成份过度受热而破坏。已熔化的培养基应8h内一次用完,剩余培养基不宜再用。

4.4 培养基适用性实验的要求及操作见本操作规程第三部分。

5 供试品抽样、保存及检验量

5.1 抽样

5.1.1 一般采用随机抽样方法,其抽样量应为检验用量(2个以上最小包装单位)的3~5倍量(以备复试或留样观察)。

5.1.2 抽样时,凡发现有异常或可疑的样品,应选取有疑问的样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。

5.1.3 凡能从药品、瓶口(外盖内侧及瓶口周围)外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品,可直接判为不合格品,无需再抽样检验。

5.2 保存

5.2.1 供试品在检验之前,应保存在阴凉干燥处,勿冷藏或冷冻,以防供试品内污染菌因保存条件不妥致死,损伤或繁殖。

5.2.2 供试品在检验之前,应保持原包装状态,严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品进行检查。

5.3 检验量

5.3.1 所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位(中药蜜丸需取自4丸、膜剂取4片以上)。

5.3.2 固体及半固体(黏稠性供试品)制剂检验量为10g。

5.3.3 液体制剂检验量为10ml。

5.3.4 膜剂除另有规定外,检验量为100cm2。

5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品,检验量可酌减。除另有规定外,口服固体制剂不低于3g,液体制剂采用原液者不得少于6ml,采用供试液者不得少于3ml,外用药品不得少于5g。

要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。

6 试验准备

6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管(1ml、10m1)、量筒、稀释剂等移至洁净实验室内。每次试验所用物品必须事先做好计划,准备足够用量,避免操作中出入洁净实验室。编号后将全部外包装(牛皮纸)去掉。

6.2 开启洁净实验室空气过滤装置,并使其工作不低于30min。

6.3 操作人员用肥皂或适宜消毒液洗手,进入缓冲间,换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手,穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。

6.4 操作前先用乙醇棉球擦手,再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围,待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。

7 供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。所用乳化剂,分散剂、中和剂或灭活剂及其用量应证明是有效的,并对微生物无毒性。供试液的制备若需用水浴加温时,温度不应超过45℃,时间不得超过30min。除另有规定外,常用的供试品制备方法如下:

7.1 液体供试品 取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

7.2 固体、半固体或黏稠液供试品 取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

7.3 非水溶性供试品

7.3.1 软膏、乳膏剂 取供试品5g(或5m1),加至含溶化的(温度不超过45℃)司盘805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的无菌混合物(溶化,温度不超过45℃)的烧杯中,即先将烧杯中无菌助溶剂混合物溶化,待温度不超过45℃时,加入供试品,用无菌玻棒搅拌成团后,分次慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1:20供试液。

7.3.2 油剂 取供试品10ml,加入无菌聚山梨酯80 5~8ml,摇匀,再加入稀释剂至100ml,作为1:10供试液。

7.3.3 栓剂 称取供试品10g,置灭菌锥形瓶中,加适量稀释剂,置45℃水浴保温10min,使溶,加入无菌聚山梨酯80 5~8ml,振摇使之乳化,再加稀释剂(稀释剂和聚山梨酯80总量为100m1),摇匀,作为1:10供试液。

7.3.4 膏剂 取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅪH“无菌检查法”)和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液100m1,振摇5~10min,萃取,待油水明显分层,取其水层作为1:10供试液。

7.4 非水溶性膜剂供试品 一般取样为100cm2,置灭菌锥形瓶中,加入适量的pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液,于45℃±1℃水浴中保温,浸泡,振摇,以供试品浸液作为l:10供试液。中药膜剂取100cm2,剪碎,加适量的pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液(通常1 cm2加1ml或2m1),浸泡,振摇,以供试品浸液作为1:10供试液。

7.5 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g,肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml,结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml,均置45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1:10供试液。

7.6 气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品,置冰箱冰冻室(-20℃以下)内约1h。取出,迅速消毒供试品容器的开启部位周围,用无菌钢锥在容器上钻一小孔,在室温轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的稀释剂(若含非水溶性成份,加适量的无菌聚山梨酯80)中,混匀,取相当于10g或10ml的供试品,再稀释成1:10的供试液。

7.7 茶剂供试品 取供试品10g,置灭菌锥形瓶中,加入稀释剂100ml,振摇2~3min,以灭菌纱布过滤(如为袋泡茶,可直接取2袋,以称样结果按1:10加稀释剂,浸泡30min)。

以上供试品如吸水膨胀,或黏度过高,可增加稀释剂的量,制成1:20~1:100供试液。

7.8 贴膏剂供试品 取规定量供试品,去掉贴剂的保护层,放置在无菌玻璃或塑料片上,粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布)覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀释剂中,用力振荡至少30min,或放置于均质仪均质l0min,或以其他方法制备成供试液。

7.9 具抑菌活性的供试品

当供试品具有抑菌活性时,应消除供试液的抑菌活性后,再依法检查。常用的方法如下:

7.9.1 稀释法 取规定量的供试液,加至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时,1ml供试液可等量分注多个平皿;控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。

7.9.2 离心沉淀法 此方法用于去除供试液中的沉淀物,对于抑菌活性较强的供试品,如供试液中有不溶颗粒、沉淀,取供试液,先以500 r/min,离心3min,取上清液进行试验,此方法用于细菌计数和控制菌(细菌)检查。

7.9.3 薄膜过滤法 见细菌、霉菌和酵母菌计数。

7.9.4 中和法 凡含汞、砷或防腐剂的供试品,可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性,制成供试液。

8 供试液的释稀(10倍递增稀释法)

8.1 取2~3支灭菌试管,分别加入9ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂(此时操作一般为:左手执试管并将塞打开,倾斜,右手执10ml吸管吸量。切勿在酒精灯火焰的正上方操作,以免火焰将供试液中的菌细胞杀灭)。加稀释剂后,试管塞应立即塞上。

8.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml,加入装有9ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液灭菌稀释剂的试管中,混匀,即得1:100供试液。以此类推,根据供试品污染程度,可稀释至1:103、1:104等适宜稀释级。每递增l稀释级,必须另换一支吸管。

稀释时,吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm,反复吸吹约10次。吸液时,应先吸至高于吸管上部刻度少许,然后提起吸管,贴于试管内壁调整液量至刻度,吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处(勿接触液面)缓慢地放出全部供试液(吸管内应无黏附或残留液体),然后将吸管放入消毒液缸内。

9 计数方法验证

由于某些供试品具有抗菌活性,在建立测定方法或原测定法的检验条件发生改变时,可能影响检验结果的准确性,必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

9.1 验证用菌株大肠埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102],金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CCMCC(B) 26003],枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[CMCC(B) 63501],白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001],黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCC(F) 98003]。

菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24~48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,培养5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/m1)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~l00cfu的孢子悬液。

菌悬液制备后,若在室温下放置应在2h内使用,若保存在2~8℃的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉菌的孢子悬液保存在2~8℃,可在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。

9.2 验证方法 验证试验分4组,至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。

9.2.1 供试品组 取最低稀释级的供试液,按每1ml供试液加入50~l00cfu试验菌,按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时,取试验菌液、供试液各1ml分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基;薄膜过滤法计数时,取供试液2ml过滤,冲洗液冲洗,并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。

9.2.2 活菌组 取上述试验菌液,测定其加入的试验菌菌数。

9.2.3 供试品对照组 取最低稀释级的供试液1ml,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

9.2.4 稀释剂对照组 为考察供试液制备过程中对微生物影响的程度,可用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml含50~l00cfu,按供试品组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。


9.3 结果判定对照组的菌回收率均应不低于70%。若供试品组的菌回收率均不低于70%,则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数;若任一次试验中供试品组的菌回收率低于70%,应建立新的方法,消除供试品的抑菌活性,并重新验证。

9.4 验证试验可与供试品的细菌,霉菌及酵母菌计数同时进行。

9.5 注意事项

9.5.1 所用标准菌种的传代次数不得超过5代。以冷冻干燥的原始菌种开启后转种培养,其培养物为第一代。

9.5.2 黑曲霉菌的菌液制备 将黑曲霉菌接种至改良马丁琼脂斜面培养基上,于20~25℃培养5~7天,使大量的孢子产生。加入3~5ml含0.05%(ml/m1)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后可用一支l0ml无菌球形毛细吸管,其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置,吸出孢子悬液至无菌试管内,将孢子悬液稀释至每毫升含50~l00cfu。

9.5.3 做试验菌的回收率试验时,加入菌量50~l00cfu为宜。加菌量过多,如薄膜法,菌落拥挤,则不好计数;加菌量过少,则误差较大。

9.5.4 进行验证试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败,应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则,如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu,那么最高稀释级是1:10?3。

若采用允许的最高稀释级供试液进行验证试验还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。如某种产品对某试验菌有较强的抑菌性能,采用薄膜过滤法的回收率为40%,而采用培养基稀释法的回收率为30%,那么应选择薄膜过滤法进行该供试品的检测。在此情况下,生产单位或研制单位应根据原辅料的微生物质量、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估,以保证检验方法的可靠性,从而保证产品质量。

10 检查法

10.1 平皿法

10.1.1 在上述进行10倍递增稀释的同时,以该稀释级吸管,吸取该稀释级供试液各1ml至每个直径90mm的灭菌平皿中,或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注2~3个平皿(一般为左手执平皿,将盖半开,右手执吸管),注皿时,将1ml供试液慢慢全部注入平皿中,管内无残留液体,防止反流到吸管尖端部。

10.1.2 阴性对照 待各级稀释液注皿完毕后,用1支1ml吸管吸取试验用稀释剂(pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液)各1ml,分别注入4个平皿中。其中2个作细菌数阴性对照;另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照,如另用YPD琼脂测定酵母菌数时,则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照。

10.1.3 倾注培养基

将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基;霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基;含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基(霉菌)和YPD琼脂培养基(酵母菌)熔化,冷至约45℃时,倾注上述各个平皿约15ml,以顺时针或反时针方向快速旋转平皿,使供试液或稀释液与培养基混匀,盖上陶瓦盖,或半盖盖,除去冷凝水后,再移去陶瓦盖后,盖上平皿盖置操作平台上待凝。在旋转平皿时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上。

10.1.4 培养

细菌计数平板倒置于30~35℃培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于23~28℃培养箱中培养5天,必要时延长至7天。逐日观察菌落生长情况,点计菌落数。

10.1.5 菌落计数

10.1.5.1 一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计,以透射光衬以暗色背景,仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之间,以及菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察,或挑取可疑物涂片镜检。

10.1.5.2 供试品如为微生物制剂,应将有效微生物菌落排除,不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定,并须观察菌落特征及染色形态。

10.1.5.3 供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料,培养基注皿后亦可能产生沉淀物,经过培养后有时形成数量很多的有形物,且难与菌落相区别。为了有利于菌落计数,可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿(1~2个平皿)。注皿后不经培养而放置于冰箱(勿结冻)中。在计数菌落时作为对照。或用含TTC营养琼脂注皿,经培养后该培养基生长的菌落为红色,衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分其他有形物。有些软膏等非水溶性供试品,经营养琼脂注皿后呈乳白色,培养后生长的菌落不易辨认和点计,为防止这种情况,也可用含TTC营养琼脂注皿。TTC的用量应以不抑制微生物生长为宜,通常使用的浓度为0.001%。

10.1.5.4 若平板上有2个或2个以上菌落重叠,肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数;若平板生长有链状或片状、云雾状菌落,菌落间无明显界线,一条链、片作为一个菌落计,但若链、片上出现性状与链、片状菌落不同的可辨菌落时,仍应分别计数,若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落,其外缘有若干性状相似的单个菌落,一般不宜作为计数用。

10.1.5.5 菌落生长呈蔓延趋势者,细菌需在24h,霉菌需在48h做初步点计(点计霉菌菌落时,轻轻翻转平板,勿反复翻转,否则使早期形成的孢子散落在平板的其他部位,又萌生新的霉菌菌落,导致计数误差)。

10.1.5.6 在培养3天点计细菌,培养5天点计霉菌时,如菌落极小,不易辨认,细菌计数可延长培养时间至5天;霉菌及酵母菌计数可延长培养时间至7天,再点计菌落数。

10.1.5.7 对有异议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时,可培养至1周再点计菌落数。

10.1.5.8 含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数,YPD琼脂培养基点计酵母菌数。两者合并计数。

10.1.5.9 在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数多的培养基中的菌数为计数结果。

10.1.6 菌数报告规则

10.1.6.1 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300cfu、霉菌菌落数平均数小于100cfu的平板计数作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。

10.1.6.2 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定,以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数;当有2个或2个以上稀释剂的菌落数符合上述规定,以最高的平均菌落数乘以稀释倍数值的值报告。

10.1.6.3 如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均茵落数小于1时,以小于1乘以最低稀释倍数报告菌数。

菌数报告规则示例见下表2。

表2 菌数报告规则示例

菌数报告

规则示例

各稀释级(供试液1mlㄍ皿)平均菌落计数(cfu)

菌数报告数

(cfuㄍg,ml,10cm2)

原液

1:10(-1)

1:102(-2)

1:103(-3)

1

——

64

8

2

640

2

——

420

64

8

6400

3

——

不可计

420

64

64000

4

——

0

0.5

0

<100

5

——

——

0

0

<100

6

——

0

0

0

<10

7

0

0

0

——

<1


10.2 薄膜过滤法

10.2.1 薄膜过滤法主要起到富集微生物、分离去除样品中对微生物生长产生干扰的因素的作用,可以有效提高检查结果的灵敏度和可靠性,是近年来微生物检查领域中日益广泛应用的一种技术手段。

10.2.2 薄膜过滤法采用的滤膜孔径应不大于0.45um。滤膜直径一般为50mm,为便于计数,以及减轻供试液堵塞滤膜的情况,在便于操作的前提下,可以选用直径更大的滤膜或薄膜过滤器。采用不同直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。

10.2.3 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,以滤膜直径为50mm的滤膜计,每张滤膜每次冲洗量不超过100ml,总冲洗量不得超过1000ml;其他直径的滤膜及薄膜过滤器可按膜面积比例调整,总的原则是避免大体积、过高流速的冲洗造成滤膜上的微生物受损伤。

10.2.4 由于供试液中一些不能通过滤膜的颗粒存在,常常造成滤膜堵塞、压力升高,严重情况时可能发生过滤装置炸裂造成安全事故或实验室污染;也可能发生由于压力过大滤膜开裂或滤膜孔径变大,造成滤膜对微生物的过滤截留失败。所以,实际操作中应考虑对薄膜过滤中的压力控制和设备的安全性,设置一定的安全压力限度,例如滤膜两侧压差不得过50psi。具体压力限度应根据具体薄膜过滤装置及滤膜确定。

10.2.5 采用适当方法去除供试液中的颗粒(前提是不能影响微生物的回收率)、适当增加薄膜面积或降低过滤液体流速可以有效降低滤膜两侧的压力差。

10.2.6 取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液,加至适量的稀释剂中,混匀,过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml,过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗方法和冲洗量见10.2.3及10.2.4。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡,否则影响微生物生长。

10.2.7 贴膏剂宜采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。

10.2.8 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

10.2.9 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。

10.2.10 菌数报告规则 以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数;若滤膜上无菌落生长,以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品),或<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

10.3 培养基稀释法

取低稀释级供试液(原液或1:10供试液或其他供试液)2份,每份各1ml,分别注入平皿中(每皿0.5ml、0.2ml或<0.2m1),每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml,混匀,凝固后,倒置培养,计数。

每份供试液所加注平板点计的菌落之和,即为每lml菌落数,共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。

10.4 结果报告

10.4.1 菌落数在100以内时,按实有数据报告。

10.4.2 菌落数大于100时,取两位有效数字报告,第三位按数字修约规则处理。

10.5 复试

供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任一项一次检验不合格,应从同一批样品中随机重新取2倍包装量的供试品,依法作单项复试两次,以三次检验结果的均值报告。若3次结果的平均值超过该品种项下的规定,判供试品不符合规定;否则,判供试品符合规定。

10.6 注意事项

10.6.1 菌落计数测定每计数单位(每皿或每膜)的最适计数范围不宜过低,通常每计数单位不应少于25cfu,低于这一限度越多误差越大,故应根据实际微生物限度标准和污染程度确定适宜的供试液稀释级数和计数测定方法。当标准限度过低或因为操作需要供试品稀释程度过高,可以取较大体积供试液通过薄膜过滤法富集计数测定。不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法见下表3。

表3 不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法

限度标准

cfuㄍg,ml,10cm2

一般2~3个供试液稀释级对应宜选用的计数测定方法

原液

1:10(-1)

1:102(-2)

1:103(-3)

1:104(-4)

<10




10

●■




100

●▲■

●■



1000


●▲■

●■

10000


●▲

●▲■

●■

●■

100000



●▲

●▲


●:平皿法(供试液体积:1mlㄍ皿);

▲:平皿法(培养基稀释法供试液体积:<1mlㄍ皿);

■:薄膜过滤法(供试液体积可以比较灵活)。

10.6.2 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时,不能接触可能污染的任何器物,灭菌吸管不得用口吹吸。

10.6.3 供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1h。否则,可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果。

10.6.4 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液,以免造成实验误差。

10.6.5 为避免细菌菌落蔓延生长,宜采取下列方法处理:

10.6.5.1 开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖,倒置斜放于净化工作台上,开机1~2h后合盖,放入培养箱培养。

10.6.5.2 换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。

10.6.5.3 加TTC 于倾注培养基前,在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml(最终浓度为0.001%),混匀后倾注平皿。

11 检验报告书写

本品按《中国药典》2010年版微生物限度检查法标准检验,结果符合或不符合规定。



表4 细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较(营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板)

菌落形态

细菌

霉菌

酵母菌





大小

差别很大,在同一平板上可出现针尖大小至大于10mm菌落

一般较大,亦有细小的菌落。在同一平板上生长的菌落大小有时不一致

多数直径为1~2mm,在同一平板上生长的菌落大小有时不一致

外观形态

多样,小而突起或大而扁平

多为圆形,有的蔓延生长为无定形

培养基表面生长者多为圆形,内层生长者为圆形、铁饼、纺锤或三角形

色泽

白、灰白或无色,亦有淡褐、淡黄及淡红色,菌落正反面颜色相同

小菌落灰白,大菌落形成孢子后颜色多样。菌落正反面颜色不同

乳白或粉红色多见,在同一平板上色调较单一

透明度

透明或不透明

小菌落半透明有明显折光性,大菌落不透明

透明较差

边缘

整齐或不整齐。有放射线状、树枝状、锯齿状、卷发状。低倍镜下一般见不到边缘

菌丝体构成,多呈放射状

整齐、低倍下可见球状.卵圆状或假菌丝状.细胞细密排列

气味

一般有臭味

往往有霉味

多带酒香味

与培养基结合

不结合

结合较牢固,不易挑起

不结合,易挑起

生长速度

一般很快

较慢

较快


形态

球或杆状,细小均一。高倍镜或油镜下可观察形态

菌丝体相互交织.成熟霉菌常有产孢组织及孢子

多数为圆或卵圆形,常有芽体相连

排列

单个、分散或有一定的排列方式

丝状交织

单个分散



二、控制菌检查

l 简述

控制菌检查是用于检查某些特定微生物(控制菌或其他致病菌),规定按一次检出结果为准,不再复试。

由于控制菌检查为一次性报告实验结果,故应注意方法的有效性确证(方法验证或阳性对照)、实验过程保障和结果确证,以提高检验结果的可靠性。既要避免漏检造成的假阴性结果。也要避免实验室污染造成的假阳性结果。

控制菌检查中,涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等,应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外,阳性菌实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准,阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。

2 方法验证

在建立供试品的控制菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时,应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证时.按各供试品微生物限度项下的规定(给药途径)选择相应的菌株,并按供试液的制备和控制菌检查法所规定的方法进行。

2.1 仪器、设备及用具

见各控制菌检查项下。

2.2 试液、指示液

见各控制菌检查项下。

2.3 培养基

见各控制菌检查项下。

2.4 方法验证用标准菌株

应根据具体品种项下的目标控制菌选择相应的验证用标准菌株,常用目标控制菌的标准菌株如下:

大肠埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B) 26003]

乙型副伤寒沙门菌Salmonella paratyphi B[CMCC(B) 50094]

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B) 10104]

生孢梭菌Clostridium sporogenes[CMCC(B)64941]

白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]

菌液制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许,接种至l0ml营养肉汤培养基内,置30~35℃培养18~24h,取均匀培养物1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含菌10~100cfu的菌悬液,其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布,经培养后计数确定。生孢梭菌接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中,置30~35℃培养18~24h,用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含10~100cfu的菌液。

2.5 供试液的制备(见细菌、霉菌及酵母菌计数)

2.6 验证方法

2.6.1 试验组取规定量供试液和10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,按相应控制菌的检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,试验菌应加在最后一次冲洗液中,冲洗后,取出滤膜接至增菌培养基中。

2.6.2 阳性对照 取10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,按相应控制菌的检查法进行检查。

2.6.3 阴性对照取相应的稀释液替代供试液,按相应控制菌的检查法进行检查。

2.7 结果判定

阳性对照组应检出试验菌,阴性对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若试验组未检出试验菌,应建立新的方法,消除供试品的抑菌活性,并重新验证。

验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。

(一)大肠埃希菌

1 简述

大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠杆菌,为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外,新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌,随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌。表明该样品受到人和温血动物的粪便污染,即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌,可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保汪人体健康,口服药品必须检查大肠埃希菌。

用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide,MUG)和靛基质(indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术,其检验步骤为:增菌培养后,转种MUG蛋白胨培养基培养,多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌,如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

原理:利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物,产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。

实验证明96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUD),约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解,产生荧光,由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍,易于观察,没有主观性,因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌基靛基质试验为阳性,故将MUG与靛基质试验结合,比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时,则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。

如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌,专属性不强。

2 仪器、设备及用具(参照细菌、霉菌及酵母菌计数)

3 试液指示液

3.1 0.9%无菌氯化钠溶液(附件二3.1)

3.2 无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)(附件二3.3)

3.3 无菌对氨基苯甲酸溶液(附件二2.2)

3.4 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液(附件二3.2)

3.5 靛基质试液(附件二2.17)

3.6 甲基红试液(附件二4.2)

3.7 V-P试液(附件二2.11,2.13)

3.8 革兰染色液(附件二2.4,2.10,2.16)

3.9 中性红指示液(附件二4.1)

3.10 亚甲蓝指示液(附件二4.3)

3.11 溴麝香草酚蓝指示液(附件二4.6)

3.12 酸性品红指示液(附件二4.7)

3.13 曙红钠指示液(附件二4.9)

4 培养基

4.1 营养肉汤(附件二5.1)

4.2 营养琼脂(附件二5.2)

4.3 胆盐乳糖(BL)培养基(附件二5.6)

4.4 4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基(附件二5.7)

4.5 乳糖发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基、5%乳糖培养基(附件二5.21,5.22)

4.6 蛋白胨水培养基(附件二5.18)

4.7 磷酸盐葡萄糖胨水培养基(附件二5.19)

4.8 枸橼酸盐培养基(附件二5.20)

4.9 曙红亚甲蓝(EMB)琼脂(附件二5.8)

4.10 麦康凯琼脂(附件二5.9)

5 准备

5.1 对照用菌液(见方法验证)

5.2 供试品的检验量(见细菌、霉菌及酵母菌计数5.3)

5.3 供试液的制备(见细菌、霉菌及酵母菌计数)

6 操作步骤

6.1 检验程序


阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时,应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10~100cfu,供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验 取稀释剂10m1加入100ml(或200 m1)相应控制菌检查用的增菌培养基中,培养,应无菌生长。

6.2 增菌培养 取胆盐乳糖(BL)培养基3瓶,每瓶各100ml。2瓶分别加入规定量的供试液(相当于供试品1g、lml、10cm2),其中1瓶加入对照菌10~100个作阳性对照,第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18~24h,必要时可延至48h。阴性对照应无菌生长。

取上述培养物0.2ml,接种至含5ml MUG培养基的试管内,培养,于5、24h在366nm紫外光下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光,为MUG阳性;不呈现荧光,为MUG阴性。观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本色,为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性、靛基质阴性,判供试品未检出大肠埃希菌。

6.3 分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时,应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动,以接种环沾取1~2环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上。培养18~24h。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌。

表1 大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润


当阳性对照的平板呈典型菌落生长时,若EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者,应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验,确认是否为大肠埃希菌。

为了规范操作,以下是对药典要求的补充。

6.4 纯培养 如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者,以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心,沾取培养物,应挑选2~3个以上疑似菌落,分别接种营养琼脂斜面,培养18~24h,作以下检查。

如平板上无单个可疑菌落,但有可疑菌团(紫黑色,或有金属光泽),应沾取可疑菌团培养物少许,或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板,培养18~24h,再挑选单个疑似菌落,纯培养,作以下检查。

6.5 革兰染色、镜检

6.5.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上,取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许,制成均匀涂片,自然或微温,再通过火焰2~3次干燥使固定。

6.5.2 滴加结晶紫染液,染色1min,水洗。

6.5.3 滴加碘液,媒染1min,水洗,以滤纸吸干余水。

6.5.4 滴加95%乙醇,脱色20~30s,至流出液无色,水洗。

6.5.5 滴加沙黄染液,复染1min,待干后,镜检。

6.5.6 染色结果

革兰阳性菌呈蓝紫色;革兰阴性菌呈红色。

大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌,或球杆菌状,亦有杆菌状。

6.5.7 注意事项

6.5.7.1 玻片必须洁净,无划痕。涂片的菌量宜少,菌液不可过浓。否则,菌细胞成堆或连成片。染色反应难于判断,不利菌细胞的形态观察。

如菌液过浓,须再取洁净载玻片进一步稀释。

6.5.7.2 培养物的菌龄以16~24h为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。

6.5.7.3 脱色是关键。脱色时间不足,菌细胞易染成阳性;脱色时间过长,菌细胞易染成阴性。

7 生化试验

7.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物,接种于乳糖发酵管,培养24~48h,观察产酸(指示剂为酸性品红者为红色;指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色),产气(小倒管内有气泡,气泡无论大小都是产气)。

为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性,亦可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌,可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。

7.2 靛基质试验(Ⅰ) 取上述斜面培养物,接种于蛋白胨水培养基,培养24~48h,沿管壁加入靛基质试液数滴,轻轻摇动试管,液面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般24h即可出现阳性结果,以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查,如靛基质是阴性,余下的蛋白胨水培养物再培养24h,作靛基质试验。

7.3 甲基红试验(M) 取上述斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48±2h,于培养液中加入甲基红指示液2~3滴(约每ml培养液加指示液1滴),轻微摇动,立即观察,呈鲜红色或橘红色为阳性,呈黄色为阴性。

7.4 乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取上述斜面培养物。接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48±2h,于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml,混匀,再加40%氢氧化钾试液0.4ml,充分振摇,在4h(通常在30min)内出现红色应判为阳性,无红色反应为阴性。

7.5 枸橼酸盐利用试验(C) 取上述斜面培养物,接种于枸橼酸盐培养基斜面上,培养2~4天,培养基斜面有菌苔生长,培养基由绿色变为蓝色时为阳性,培养基颜色无改变、无菌生长为阴性。

8 结果判断

8.1 当阴性对照试验呈阴性,阳性对照试验MUG呈阳性,供试品MUG阳性、靛基质阳性,报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。MUG阴性、靛基质阴性,报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。

8.2 MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为-+??、革兰阴性杆菌,报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌;MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为++??、革兰阴性杆菌,报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。

8.3 供试品培养物检查不符合8.2二项中的任一项,报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。

8.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌,不能做出检验报告。

9 注意事项

9.1 MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外,尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株;以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌,其MUG为阳性。因此,在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量,可排除革兰阳性菌的干扰。在胆盐乳糖培养基中志贺菌、沙门菌较难生长。

9.2 配制MUG培养基时,务必校正pH值,灭菌后pH不得过7.4,否则pH值偏高,MUG分解,本身则显荧光;分装MUG培养基的试管应挑选,试管、蛋白胨不得显荧光。

9.3 培养时间 供试品培养液接种于MUG培养基中,一般培养5h和24h要观察是否产生荧光,如荧光很微弱,不能准确判断时,可延长培养至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同,对底物和底物的浓度反应的差异;培养基中选择因子的影响;培养时问、温度;pH值的改变;大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等,对结果的判断亦有影响。

9.4 结果观察 取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外光灯下观察,阳性对照管应有较强的蓝白色荧光,阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光,应仔细观察比较,或将各管调换位置(阴性管居中),适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈,影响供试品管与阴性对照管的观察时,亦可移去阳性对照管。

9.5 药品中污染的大肠埃希菌,易受生产工艺及药物的影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化,挑取可疑菌落往往凭经验,主观性较大,务必挑选2~3个以上菌落分别做IMViC试验鉴别,挑选菌落越多,检出阳性菌的机率越高,如仅挑选一个菌落做IMViC试验鉴别.则易漏检。

9.6 在IMViC试验中,以灭菌接种针沾取菌苔,首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上,然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上,以免产生假阳性结果。

根据试验资料,发现某些菌培养3天后,构橼酸盐利用试验产生阳性,故仅培养2天是不够的,枸橼酸盐利用试验培养时间可延长至4天。

9.7 以IMViC试验来判断大肠埃希菌属中的大肠埃希菌是含混的。IMViC试验为++??者,除大肠埃希菌外,还有非活跃大肠埃希菌(E.coli jnactive)、弗格森埃希菌(E.fergusonii)、赫尔曼埃希菌(E.hermanii)。IMViC试验为-+??者,除大肠埃希菌外,还有非活跃大肠埃希菌(E.coli inactive)、伤口埃希菌(E.vulneris)、蟑螂埃希菌(E.blattae)。

9.8 阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阳性对照菌液的制备、计数及加入含供试品的培养基中等操作,不能在检测供试品的洁净实验室或净化台上进行,必须在单独的隔离间或净化台操作,以免污染供试品及操作环境。

9.9 在各类供试品中检测大肠埃希菌及其他控制菌,按一次检出结果为准,不再抽样复验。检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留1个月,备查。


(二)大肠菌群

1 简述

大肠菌群(Coliform)是指37℃生长时能发酵乳糖,在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属(Escherichia)的多数菌外,还包括肠杆菌科的肠杆菌属(Enterobacter)、枸橼酸菌属(Citrobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)的多数菌。大肠菌群包括了正常人畜肠道内需氧的的大多数革兰阴性杆菌。以大肠菌群作为卫生指示菌比控制大肠埃希菌具有广泛的卫生学意义,检查方法简便。因此,国际上以大肠菌群作为药品、食品、饮水等的卫生指示菌,对卫生质量的要求更严格。

大肠菌群的检查通过增菌、分离、革兰染色、镜检和确证试验等步骤。

2 仪器、设备及用具(见大肠埃希菌检查法)

3 试液、指示液(见大肠埃希茵检查法)

4 培养基

4.1 乳糖发酵培养基(附件二5.21)

4.2 乳糖胆盐发酵培养基(附件二5.22)

4.3 曙红亚甲蓝(EMB)琼脂(附录5.8)

4.4 麦康凯琼脂(附录5.9)

5 对照用菌液(大肠埃希菌,同控制菌方法验证2.4)

6 操作步骤

6.1 操作程序




6.2 增菌培养 取乳糖胆盐发酵管3支,分别加入1:10稀释的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1m1)、1:100稀释的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)和1:1000稀释的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)。另取1支乳糖胆盐发酵管,加入稀释剂1ml作为阴性对照。均培养18~24h,观察结果。

加供试液的乳糖胆盐发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气,则判该管未检出大肠菌群。若乳糖胆盐发酵管产酸产气,应进一步分离培养。

6.3 分离培养 将上述产酸产气的发酵管中的培养物,分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24h。

大肠菌群的菌落在曙红亚甲蓝琼脂培养基平板上呈紫黑色或紫红色,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润;在麦康凯琼脂培养基的平板上呈鲜桃红色或粉红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润。若平板上无菌落生长,或生长的菌落与上述菌落特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长有疑似菌落,且为革兰阴性无芽孢杆菌,应进行确证试验。

6.4 确证试验 从上述分离平板上挑选4~5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培养24~48小时。若产酸产气,判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。

6.5 结果判断 根据大肠菌群的检出管数,按表2报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表2 大肠菌群MPN(Most probable number)表

各供试品量的检出结果

最可能的大肠菌群数N

(个ㄍg或ml)

1.0g或1.0ml

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

>102

10<N<102

1<N<10

<1

注:+ 检出大肠菌群。- 未检出大肠菌

7 注意事项

7.1 加供试液的乳糖胆盐发酵管,由于有的药渣颜色较深或沉淀物较多,干扰结果的观察。应仔细观察倒管底部或试管壁、培养液表面有无气泡。针尖大的气泡也是产气。

7.2 乳糖胆盐发酵培养基内的倒管不小于30mm×3mm(内径)。否则,倒管被药渣遮挡,不便观察结果。

7.3 加供试液的乳糖胆盐发酵管,经培养后,其倒管内无论产气多少,均应做分离培养,革兰染色、镜检。如产气太少,可延长培养时间。

7.5 尽可能多挑选曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基平板上大肠菌群的可疑菌落,做乳糖发酵确证试验。挑可疑菌落越多,可提高大肠菌群检出率。


(三)沙门菌

1 简述

沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌,按《Bergey系统细菌学手册》第一卷(1984),沙门菌分5个亚属,2003年出版的第八版的《临床微生物手册》将沙门菌属分成两个菌种及肠炎沙门菌和乍得沙门菌,其中的肠炎沙门菌分6个亚属,包括常见的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、丙型副伤寒、鼠伤寒,猪霍乱等沙门菌在内,当时已发现2501个血清型。O抗原抗血清的A-E群包含了沙门菌分离株的95%,所以用沙门菌A-FO多价血清进行沙门菌初筛试验。药品中的沙门菌,是以鉴定沙门菌属为准,即对每10g(或10m1)药品中是否检出沙门菌作出检验报告。

由于沙门菌血清型繁多,各血清型的生化及血清学特性虽密切相关,却不尽相同,采用一种增菌培养基和两种分离培养基,不可能涵盖所有沙门菌的最适增菌及分离条件。此外,由于药品在生产过程中,常受到加热、干燥等加工步骤的影响,药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态,故须在增菌培养前先进行预增菌,然后再进行增菌及分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等步骤。

2 仪器、设备及用具(见大肠埃希菌检查法2)

3 试液指示液(参见大肠埃希菌检查法3)

3.1 无菌脲试液(附件二2.5)

3.2 酚磺酞指示液(附件二4.4)

3.3 亮绿试液(附件二2.9)

3.4 氰化钾试液(附件二2.14)

3.5 溴甲酚紫指示液(附件二4.5)

3.6 革兰染色液(附件二2.4,2.10,2.16)

3.7 沙门菌属A~F“0”多价血清(0多价1)。

4 培养基

4.1 营养琼脂培养基(附件二5.2)

4.2 营养肉汤培养基(附件二5.1)

4.3 半固体营养琼脂培养基(附件二5.3)

4.4 曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)(附件二5.8)

4.5 麦康凯琼脂培养基(MacC)(附件二5.9)

4.6 四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)(附件二5.11)

4.7 三糖铁琼脂培养基(TSI)(附件二5.10)

4.8 胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)(附件二5.13)

4.9 沙门菌扁志贺菌属琼脂培养基(S.S)(附件二5.12)

4.10 蛋白胨水培养基(附件二5.18)

4.11 脲(尿素)琼脂培养基(附件二5.23)

4.12 氰化钾培养基(附件二5.24)

4.13 赖氨酸脱羧酶培养基(附件二5.25)

5 对照用菌液

取乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B) 50094]的培养物少许,接种至10ml营养肉汤培养基内。30~35℃培养18~24h后,用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释浓度相当于10~100cfuㄍml,作阳性对照用菌液。其菌液浓度可用平板菌落计数法测得。

6 操作方法

6.1 准备工作:[见细菌、霉菌(酵母菌)计数6 ]

6.2 增菌培养

6.2.1 预增菌取营养肉汤培养基3份,每份200ml,1份加入10g或者10ml供试品,混匀;1份加入供试品及阳性对照菌10~100cfu,混匀;1份加入稀释剂10ml作阴性对照,30~35℃培养18~24h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明,无菌生长。

6.2.2 增菌培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶,分别吸取1ml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中,培养18~24h。

6.3 分离培养轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶,分别以接种环沾取1~2环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝(EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个,倒置培养24~48h,必要时延长至40~48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。沙门菌在上述平板上的菌落形态特征见下表。


表3 沙门菌的菌落特征

平板

菌落形态

胆盐硫乳琼脂(DHL)

无色至浅橙色.半透明,菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色

沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)

无色至淡红色,半透明或不透明,菌落中心有时带黑褐色

曙红亚甲蓝琼脂(EMB)

无色至浅橙色,透明或半透明,光滑湿润的圆形菌落

麦康凯琼脂(MacC)

无色至浅橙色,透明或半透明,菌落中心有时为暗色


由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖,不产酸,菌落不着色,一般为无色半透明,多数沙门菌因产生H2S,菌落中心呈现黑色甚至全黑色,在DHL琼脂平板上较为明显。在SS琼脂平板上,H2S特征有时不明显,沙门菌属亚属III因多数菌株发酵乳糖,故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色,但由于产生H2S,在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心。在上述培养基上,有些非沙门菌属细菌,也可呈现类似沙门菌菌落形态,须进一步鉴别。由于药物的影响或非典型菌株的存在,沙门菌菌落可呈现非典型形态,如色泽变深,菌落粗糙等,应注意辨别。

6.4 初步鉴别试验

从每个供试品的分离平板上挑取2~3个疑似菌落(菌落形态特征与表3所列的形态特征相符或疑似)分别接种于三糖铁琼脂斜面,接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位,沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面(或者克氏双糖铁琼脂斜面)并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面,培养18~24h,观察结果。

疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为:①斜面红色(产碱),底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸);②斜面红色,底层黄色;③斜面黄色,底层黑色,并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体,使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂,但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色,斜面未见红色底层未见黄色,或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。

将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验,血清凝集试验及革兰染色,镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。

6.5 生化试验

6.5.1 靛基质试验 用接种环沾取少许培养物,接种到蛋白胨水培养基中,照大肠杆菌检查法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。

6.5.2 脲酶试验 用接种环沾取少许培养物,划线接种于脲琼脂斜面,培养24h,观察结果。斜面变为红色为阳性反应,沙门菌属为阴性反应。

6.5.3 氰化钾试验 将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养20~24h,用接种环沾取培养液1环,接种至氰化钾培养基内,另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管,接种后即以橡胶塞塞紧,培养24~48h,观察结果。对照管内有菌生长(混浊),而试验管也有菌生长为阳性反应;对照管有菌生长(混浊)而试验管无菌生长(清亮)为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。

本试验应十分注意密封管口,夏天分装培养基宜在冰浴中进行,防止氰化钾分解,产生氢氰酸逸出,致使培养基内氰化钾浓度降低,不能抑制细菌生长,造成假阳性。

氰化钾为剧毒品、操作时须谨慎,切勿用口吸液。用后的培养基每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾0.5ml去毒。然后再灭菌、洗涤。

6.5.4 赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物,接种在赖氨酸脱羧酶培养基中,同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管,培养24~48h观察结果。对照管黄色(产酸),试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱);试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。

6.5.5 动力试验用接种针沾取培养物,穿刺接种于半固体营养琼脂管中,培养24h,观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象;无动力的细菌仅能沿穿刺线生长,不向外扩散,培养基仍呈清晰透明状;无动力表现的培养物,应在室温保留2~3天后,再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外,均具有周身鞭毛,能运动,动力试验阳性。沙门菌生化反应的初步鉴别见下表。

表4 沙门菌与有关细菌在三糖铁琼脂及初步生化试验的鉴别

序号


靛基质

脲酶

氰化钾

赖氨酸脱羧酶

判定菌属

斜面

底层

产气

硫化氢

1.1

+/-

+/-

沙门菌属

1.2

+/-

沙门菌属III

2

+/-

缓慢爱德华菌属

3

+/-

+/-

+/-

-/+

-/+

+/-

弗劳地柠檬酸杆菌

4.1

+S

奇异变形杆菌

4.2

+/-S

普通变形杆菌

5

+/-

+/-

+/-

+/-

大肠埃希菌

6

-/+

志贺菌属

7.1

+/-

阴沟肠杆菌

7.2

+/-

肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌

8

+S/-

+/-

普罗菲登斯菌属、摩根菌属

9

+/-

-/+

蜂房哈夫尼亚菌、黏质沙雷菌


针对三糖铁琼脂上的反应,+产酸(黄色),阳性,阳性率,>90%;-产碱(红色),阴性,阴性率,>90%;+/-多数阳性、少数阴性;+S产生少量气体;生化试验的结果参见本章6.5内容;+阳性,阳性率,>90%;-阴性,阴性率,>90%;+/-多数阳性、少数阴性,-/+多数阴性、少数阳性(本表依据何晓青卫生防疫细菌检验,参考第八版《美国临床微生物手册》,反应序号1除典型反应外,脲酶、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验三项中有一项异常;反应序号2仅靛基质阳性;可结合血清学凝集试验,或加做部分生化试验,判定是否为沙门菌,其他情况可排除沙门菌。

6.6 血清学凝集试验

6.6.1 准备1片洁净的灭菌载玻片,在近中央的一端,以直径3mm接种环沾取沙门菌属0多价1血清2~3环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹,长约1.5cm,宽约0.5cm。另一端用生理盐水代替血清同法操作,作为阴性对照。

6.6.2 用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少许,在血清和盐水中混匀。菌量要适当,勿过浓。

6.6.3 将玻片前后倾斜数次,以暗色背景衬底,在良好的照明条件下进行观察,阴性对照不出现凝集现象,试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时,应将玻片置培养皿内,并放一个湿棉球在旁边,盖上皿盖,经约20min,再观察结果。如果仍然没有出现凝集,应取斜面培养物,置含少量生理盐水的试管中,制成浓菌悬液,在100℃水浴中保温30min,以除去可能存在的Vi抗原,待冷,再做凝集试验,如出现凝集,仍判为阳性反应;如不出现凝集现象,则为阴性反应。

6.6.4 如对照试验出现凝集现象为非特异反应,须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验。

7 结果判断

7.1 供试品培养物为革兰阴性杆菌,三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应,沙门菌属0多价1血清凝集试验阳性反应(含待检培养物经l00℃30min处理后凝集试验为阳性反应),报告10g或10ml供试品检出沙门菌。

7.2 供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符合沙门菌属反应及沙门菌属0多价1血清凝集试验为阴性反应(含待检培养物经100℃30min处理后凝集试验为阴性反应),报告1g或1ml供试品未检出沙门菌。

7.3 供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位进一步鉴定后,再作报告。

7.3.1 供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应,沙门菌属0多价1血清凝集试验阴性反应。

7.3.2 供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应,沙门菌属0多价1血清凝集反应呈阳性反应。

7.4 对已检出沙门菌的供试品分离菌种,有条件者,应进一步作菌型鉴定。根据检出菌的特性,推断可能菌型,增加生化试验项目及沙门菌单因子血清“O”及“H”凝集试验进行鉴定。

8 注意事项

8.1 试验用培养基,需经过质量鉴定,用已知典型反应菌株(如乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B) 50094]进行测试,其灵敏度及特征性反应应符合要求。培养基需在规定条件保存,在规定时间内使用。分离平板在使用前应置30~35℃温箱内倒置孵育1~2h,使其表面温暖湿润,利于分离沙门菌。

8.2 在对供试品进行测试的同时,需做阳性菌对照及阴性对照。阴性对照应无菌生长,阳性对照应显示阳性结果,否则检验结果无效。在进行阳性菌对照试验时,应与供试品检验分开操作,避免污染。特别是用接种环沾取菌液进行接种或分离时,避免动作过大,形成气溶胶,污染供试品检验用具及操作环境。

8.3 为保证试验方法的可靠性,对分离平板上的疑似菌落,应多选取几个菌落同时进行试验。挑取菌落时,不要在分离平板菌落密集部位挑取可疑菌落,而应在菌落分布稀疏部位挑选。

8.4 生化试验及血清学试验的被鉴定培养物必须是纯培养物,否则,不可能得到正确结果。如遇血清学凝集试验阳性而生化试验不符合时,应首先检查培养物的纯度。对已污染的培养物,不应丢弃,因为污染菌可能掩盖沙门菌,故应对被污染的培养物重新分离,仔细选取单个菌落再进行试验。

8.5 所有生化反应均需按照规定的试验要求进行,如观察三糖铁琼脂斜面反应的时间,应在24士2h,时间过短过长,都可能出现错误结果判断。又如氰化钾试验,试管口应密塞,否则氰化钾浓度降低,致使抑菌作用下降,产生错误的判定结果。

8.6 血清凝集试验的影响因素甚多,除与电解质、pH、温度有关外,须特别注意抗原与抗体用量的比例恰当,只有当二者浓度适当时,凝集反应方明显可见。由于本法试验用多价血清,其凝集力相对较弱,试验用菌液量切不能过大。测试前,应用已知阳性菌测试以掌握适宜菌液浓度。

8.7 沙门菌为肠道重要致病菌,操作时应特别注意防止分离待检菌及阳性对照菌对操作环境及试验的污染。所有用过的增菌、分离、生化试验培养基、血清学凝集试验及染色镜检后的玻片等,均需经灭菌后方能洗涤。


(四)铜绿假单胞菌

1 简述

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),习称绿脓杆菌,为假单胞菌属菌种,广泛分布在土壤,水及空气,人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在,故可通过环境和生产的各个环节污染药品。本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤,眼科及其他外科疾患中常引起继发感染,由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性,增加了治疗的难度、国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为检查项目之一。铜绿假单胞菌按增菌、分离、纯培养、革兰染色镜检及生化试验等步骤进行检验。

2 仪器、设备和用具(见大肠埃希茵检验法2)

3 试液、指示液

3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(附件二3.1,3.3)

3.2 1%二盐酸二甲基对苯二胺试液(附件二2.1)

3.3 盐酸试液(附件二2.12)

3.4 三氯甲烷(附件二1.57)

4 培养基

4.1 营养肉汤培养基(附件二5.1)

4.2 胆盐乳糖(BL)培养基(附件二5.6)

4.3 营养琼脂培养基(附件二5.2)

4.4 溴代十六烷基三甲胺(附件二5.14)

4.5 绿脓菌素测定用培养基(PDP琼脂)(附件二5.26)

4.6 明胶培养基(附件二5.27)

4.7 硝酸盐胨水培养基(附件二5.28)

5 对照用菌液

铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]营养琼脂斜面培养物少许,接种至10ml营养肉汤培养基内,于30~35℃培养18~24h后,用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释浓度相当于10~100个cfu/ml,作阳性对照用菌液。其菌液浓度可在做阳性对照实验的同时用平板菌落计数法测得。

6 操作方法

6.1 供试品的取样量[见细菌、霉菌(酵母菌)计数6]

6.2 供试液的制备[见细菌、霉菌(酵母菌)计数7]

6.3 增菌培养

取胆盐乳糖培养基3份,每份100ml,1份加入1:10供试液10ml(相当于供试品1g或1ml);1份加入供试液及阳性对照菌;l份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于30~35℃培养18~24h(必要时可延至48h)。阴性对照菌应无菌生长。

6.4 分离培养

轻轻摇动上述增菌培养液,以接种环取1~2环培养液(如有菌膜应挑取之),划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板,于30~35℃培养18~24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐,光滑湿润,呈灰白色,周边略呈扩散现象,在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散,使培养基显蓝绿色,但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和黏液型等,应注意挑选。

6.5 纯培养

供试品分离平板生长6.4所述典型菌落或呈疑似菌落时,以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心,沾取培养物,应挑取2~3个疑似菌落,分别接种营养琼脂斜面,培养,作以下检查。

6.6 革兰染色镜检

6.6.1 革兰染色(见大肠埃希菌检查6.5)

6.6.2 镜检

铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌,单个,成对或成短链排列。

6.7 生化试验

可用铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]做生化试验的阳性对照株。

6.7.1 氧化酶试验

取一小块白色洁净的滤纸置平皿内,以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许,涂在滤纸上,随即滴加1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30s内,纸片上的培养物出现粉红色,逐渐变为紫红色,即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。

本试验应注意:

(1)试验菌落(苔)必须新鲜,陈旧培养物反应结果不可靠。

(2)试验避免与铁、镍等金属接触,不可用普通接种针(环)(白金材料除外)挑取菌(苔),否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。

(3)试剂宜新鲜配制,放置过久,二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。

(4)反应需在有氧条件下进行,勿滴加试剂过多,以免浸泡培养物使之与空气隔绝,造成假阴性反应。

(5)麦康凯、SS培养基等含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验,因为糖分解产酸抑制氧化酶活性。

6.7.2 绿脓菌素试验

取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基(PDP)斜面上,30~35℃培养24h后,观察斜面有无色素,如有色素,在试管内加三氯甲烷3~5ml,以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在三氯甲烷内。静置片刻,待三氯甲烷分层,用吸管将三氯甲烷移至另一试管中,加入盐酸试液(1mol/L)约1ml,振摇后静置片刻,如在盐酸液层内出现粉红色、即为阳性反应,无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的PDP琼脂培养基斜面作阴性对照,阴性对照试验应当呈阴性。如培养基斜面无色素产生,应于室温培养l~2天再按上法试验。凡经再次检验,绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。

6.7.3 硝酸盐还原产气试验

以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中,置30~35℃培养24h,观察结果。如果在培养基内的小倒管中有气体产生,即为阳性反应,表明该培养物能还原硝酸盐,并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。

6.7.4 42℃生长试验

以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9%无菌氯化钠溶液中,制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上,立即置41℃士1℃的恒温水浴箱内,务使整个斜面浸没在水浴中,培养24~48h,斜面如有菌苔生长者为阳性反应;无菌苔生长为阴性反应。

6.7.5 明胶液化试验

以接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许,穿刺接种于明胶培养基中,穿刺深度应接近培养基的底部,于30~35℃培养24h。取出放入0~4℃冰箱内10~30min。如培养基呈溶液状,即为明胶液化试验阳性反应;如明胶呈凝固状,为阴性反应。

本试验应注意:

(1)本试验接种前,培养基应为固态,否则需将培养基置冰箱内使之凝固后,再穿刺接种。

(2)试验应同时设未接种细菌的阴性对照管,与试验管同时培养并观察结果。

7 结果报告

7.1 供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌,氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者,即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。

7.2 供试品培养物氧化酶试验阳性,镜检为革兰阴性杆菌的培养物,绿脓菌素试验阴性时,其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时,亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。

7.3 凡与7.1与7.2结果不符时,报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞茵。

8 注意事项

8.1 铜绿假单胞菌污染药品后,因生产工艺和药物的影响,在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形态可产生非典型形态。为防止漏检,在挑取疑似菌落时,宜取2~3个以上菌落,分别进行检验,以提高铜绿假单胞菌的检出率。

8.2 绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要特征,但色素的产生受许多因素的影响,除菌株差异及变异外,培养条件是重要因素,温度、培养基成分等皆可影响色素产生。培养基中琼脂、蛋白胨等均应事先测试,选用适宜品牌,试验时并用阳性菌株作对照试验。


(五)金黄色葡萄球菌

1 简述

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为葡萄球菌属中的一种,广泛分布于自然界。空气、土壤、水及物品上,人和动物皮肤及与外界相通的腔道中,也经常有本菌存在。本菌可产生多种毒素及酶,这些毒性物质能引起局部及全身化脓性炎症,严重时可发展成为败血症和脓毒血症,是人类化脓性感染中重要的病原菌。本菌抵抗力较强,干燥情况下能生存数月,80℃30min的条件下尚能存活,5%石碳酸或0.1%升汞溶液10~15min才会被杀死。

金黄色葡萄球菌检查按增菌、分离、纯培养、革兰染色镜检和血浆凝固酶试验等步骤进行。本法适用于外用药品及一般滴眼剂、眼膏剂的检查。

2 仪器、设备及用具(见大肠埃希菌检查法2)

3 试液、指示液

3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)(附件二3.1,3.3)

3.2 革兰染色液(附件二2.4,2.10,2.16)

3.3 无菌枸橼酸钠氯化钠溶液(附件二2.7)

3.4 血浆的制备

以无菌注射器吸取灭菌的含5%枸橼酸钠的0.9%的氯化钠溶液1ml,用无菌操作采取家兔(或羊、人)血9ml,轻轻混匀数分钟。待血液不凝固时,徐徐放入灭菌离心管中,离心(500 r/min离心5min),分离血浆,用灭菌吸管将血浆转移至灭菌试管中,置冰箱备用。临用前必须用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌(如金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003])测试,证明血浆合格后,方可用于实验。

3.5 1%酚磺酞指示液(附件二4.4)

4 培养基

4.1 营养肉汤培养基(附件二5.1)

4.2 营养琼脂培养基(附件二5.2)

4.3 亚碲酸盐肉汤培养基(附件二5.15)

4.4 卵黄氯化钠琼脂培养基(附件二5.16)

4.5 甘露醇氯化钠琼脂培养基(附件二5.17)

5 对照用菌液

取金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]营养琼脂斜面新鲜培养物少许,接种至10ml营养肉汤培养基中,30~35℃培养18~24h,用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释浓度相当于10~100cfu/ml,作阳性对照用菌液。其菌液浓度可在做阳性对照实验的同时用平板菌落计数法测得。(见方法验证用标准菌株2.4)

6 操作方法

6.1 供试品的检验量[见细菌、霉菌(酵母菌)计数6]

6.2 供试液的制备[见细菌、霉菌(酵母菌)计数7]

6.3 增菌培养

取营养肉汤(或亚碲酸钠肉汤)培养基3份,每份100ml,1份加入10ml供试液,1份加入供试液及阳性对照菌,1份加入与供试液等量的0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为阴性对照,置30~35℃培养18~24h(必要时可延至48h)。阴性对照应无菌生长。

6.4 分离培养将上述供试品增菌培养液,以接种环沾取1~2环培养液,划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上,置30~35℃培养24~72h。当供试品分离平板无菌落生长,或有菌落生长但不同于下表所列特征,可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。

表5 金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征

培养基

菌落形态特征

卵黄氯化纳琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,光滑湿润,外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈,菌落直径1~2mm

甘露醇氯化纳琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐.光滑湿润.外周有黄色环。菌落直径0.7~1mm


6.5 纯培养

当供试品分离平板生长菌落与表1所列菌落特征相似或疑似时,应选取2~3个以上菌落,分别用接种针,轻轻沾取菌落中心表面培养物,接种于营养琼脂斜面上,于30~35℃培养18~24h,取营养琼脂斜面培养物作革兰染色、镜检及接种营养琼脂肉汤于30~35℃培养18~24h做血浆凝固酶试验。

6.6 革兰染色、镜检

6.6.1 革兰染色(见大肠埃希菌检查法6.5)

6.6.2 镜检金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌,无芽孢,一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状,亦可呈单个、成双或短链状排列。

6.7 血浆凝固酶试验

试管法:取无菌试管(10mm×100mm)3支,各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1:1)0.5ml,1支加入琼脂斜面培养物菌悬液(或被检菌的营养肉汤培养液)0.5ml,其余2支作对照管:1支加入金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]培养物菌悬液或营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照;另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。三管同时置37℃水浴或恒温培养箱,3h后开始检查,以后每隔适当时间观察一次,直至24h。检查时,轻轻将试管倾斜(动作勿大),仔细观察,阴性对照管血浆流动自如,阳性对照管血浆呈凝固状,试验管呈凝固者为阳性反应;不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时,应另制备血浆,重新试验。

7 结果判断

如果革兰染色结果清晰可靠(必要时加做已知革兰染色结果的细菌进行染色质量控制),凝固酶试验阴性对照试验呈阴性,阳性对照试验呈阳性结果,供试品培养物按下列情况报告或处理:

7.1 疑似菌革兰染色呈阳性球菌,血浆凝固酶试验阳性反应者,报告1g或1ml供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种)。

7.2 革兰染色镜检不是革兰阳性球菌,或血浆凝固酶试验阴性反应,报告1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。

7.3 阴性对照有菌生长,试验结果无效。

7.4 阳性对照试验呈阴性结果,应当加做验证试验,考察检品是否有抑菌活性。

8 注意事项

8.1 金黄色葡萄球菌在上述两种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响或非典型菌株存在,亦可呈橙黄色、柠檬色或白色。做控制菌检查,对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌的筛查,以防漏检金黄色葡萄球菌。培养基存放时间和培养时间影响色素产生,故培养基应新鲜配制。培养时间宜48h以上。

8.2 如果使用干燥培养基,应按说明书配制,注意pH值是否符合规定,必要时应校正pH后灭菌使用。

8.3 血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应。此外,观察结果时不要摇动试管,因凝固初期凝块易破坏,引起假阴性试验。

8.4 葡萄球菌属在新版《Bergey手册》中共收载为28种,在微生物菌种鉴定中目前应用较多的2003年出版的第八版《美国临床微生物手册》共收录35个菌种,44个菌型。常见有金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌3种。可参照下表进行鉴定。其中又以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鉴别最为重要。

表6 3种葡萄球菌的主要性状

性状

金黄色葡萄球菌

表皮葡萄球菌

腐生葡萄球菌

菌落色素

主要为金黄色

主要为白色

主要为柠檬色

大小(菌落直径)

0.8~1.0mm

0.5~1.5mm

0.5~1.5mm

α溶血毒素

-/极少+

甘露醇




需氧

d

d

厌氧

凝固酶

卵黄反应

耐热DNA酶

对新生霉素敏感性

S

S

R

噬菌体分型

多数能分型

不能分型

不能分型

A蛋白

致病性

弱或无

d结果不确定,S敏感,R耐药

8.5 目前商品化的金黄色葡萄球菌检测试剂多家微生物相关制剂公司有售,试剂具有较好的稳定性、准确性。商品化的检测试剂应当在适当的条件下保存,在有效期内应用。


(六)梭菌

1 简述

梭菌属(Clostridium)过去称为梭状芽孢杆菌属,菌体1um×5um左右的革兰阳性杆菌,能形成芽孢。芽孢多大于菌体的宽度,细菌膨胀呈梭形,故名梭状芽孢杆菌。该菌属中主要病原菌有产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)和艰难梭菌(C.difficile),均能产生强烈的外毒素使人和动物致病。因此,对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品,必须控制梭菌。

检查梭菌的方法主要是增菌产毒培养和镜检形态观察,必要时做分离培养后再行鉴定。

2 仪器、设备及用具

2.1 玻璃器皿

试管(30mm×200mm)等。洗涤干净,无残留抗菌物质,包扎后,灭菌备用[见细菌、霉菌(酵母菌)计数]。

2.2 天平、离心机、显微镜、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱[见细菌、霉菌(酵母菌)计数]。

2.2.1 天平、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱等应定期进行校验。

2.2.2 厌氧培养袋、箱(罐)等(有商品供应),经测试后选用。

2.3 洁净实验室或净化工作台[见细菌、霉菌(酵母菌)计数2.1.1]。

2.4 手术镊、手术剪及取样匙,应严密包扎,灭菌备用。

3 试液

3.1 革兰染色液(附件二2.10,2.16,2.4)

3.2 厌氧指示剂(附件二4.8)

3.3 3%过氧化氢溶液

3.4 75%乙醇溶液

3.5 碘酊溶液或碘伏

3.6 0.9%无菌氯化钠溶液(附件二3.1)

3.7 苯扎溴铵(1:1000)溶液

4 培养基

4.1 硫乙醇酸盐流体培养基(附件二5.33)

4.2 梭菌增菌培养基(附件二5.29)

4.3 哥伦比亚琼脂培养基(含庆大霉素20mg/L和不含庆大霉素)(附件二5.30)

5 对照用菌液

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]。

菌液制备 取生孢梭菌接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中,置30~35℃培养18~24h,用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含10~100cfu的菌液。生孢梭菌标准菌液计数可取每毫升含100~1000cfu的菌液0.1ml涂布于哥伦比亚琼脂培养基平板置厌氧条件下培养48~72h计数;也可以取每毫升含10~100cfu的菌液1ml接种于不少于12ml硫乙醇酸盐流体培养基中,摇匀,置30~35℃培养18~20h计数其中的灯笼状菌团,一般情况下该灯笼状菌团数与平板计数菌落数相当。[见方法验证2.4]

生孢梭菌菌种的保存可取其硫乙醇酸盐流体培养物混匀、冻存管分装、超低温保存(如-80℃),用时取出自然解冻、经硫乙醇酸盐流体培养基复苏、复壮,制备新鲜培养物使用。

6 操作方法

6.1 不同剂型样品的前处理

6.1.1 散剂除去包装,直接称取规定量的样品即可。

6.1.2 胶囊除去包装,连壳一起称取规定量样品。

6.1.3 软膏剂及栓剂称取样品10g,按细菌、霉菌、(酵母菌)计数6.23规定的适宜方法乳化,乳化后加入预热至45℃的0.9%无菌氯化钠溶液,制成1:20供试液。

6.2 增菌培养

6.2.1 厌氧培养装置的准备除商品厌氧培养袋、箱、罐按使用说明要求准备外,实验室亦可用真空干燥器、标本瓶或其他适宜容器替代使用,可选用下列一种方法制备厌氧条件:

6.2.1.1 冷触媒法 临用前,取试管或其他适宜容器3支,1支称入硼氢化钠0.22g(以厌氧培养容器容积1L计),1支称取枸橼酸0.33g、碳酸氢钠0.37g,另1支放入经活化的钯粒约1g,与接种后的供试品培养管(或平板)及厌氧指示剂管1支,同时置于厌氧培养容器内,随即各加水5ml于前2支管(或容器)中,迅速密封容器盖。钯粒为覆盖钯的氧化铝的球状或条状颗粒(有商品出售),用前需经160℃干烤2h,或在电炉上灼烧5min使其活化。由于每用1次便失去催化性,因此,再次使用时需按上法活化后方能使用。将钯粒若干置室温水中,附有大量气泡者为活性良好,可直接使用。此法可作为钯粒的活性检查。

6.2.1.2 焦性没食子酸法用前,取培养皿或其他适宜容器1支,加入焦性没食子酸10g及无水碳酸钠5g(以厌氧容器容积1L计),与接种后的供试品培养管(或平板)及厌氧指示剂管1支同时置于厌氧容器内,迅速密封容器盖。

6.2.2 增菌培养 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)4份,其中2份置80℃保温10min后迅速冷却。上述4份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中,其中2份(直接1份,处理后1份)梭菌增菌培养管中分别加入阳性对照菌(10~100cfu)。置厌氧条件下培养48h。

6.3 分离培养取上述每一培养物0.2ml,分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上,置厌氧条件下培养48~72h。若供试品平板上无菌落生长,判供试品未检出梭菌;若供试品平板上有菌落生长,应挑选2~3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

6.4 革兰染色镜检取疑似菌落涂片,作革兰染色、镜检,观察染色及菌体特征。本菌形态特征较为典型。培养后形成的芽孢,初呈“火柴头”状卵圆形,继而膨大呈球形,在菌体末端如鼓槌状。培养时间至72h以上时,菌体可自溶而消失,仅见游离的芽孢囊,一般染色时呈圆圈状。染色镜检有卵圆形至球形的芽孢,大于菌体,着生于菌体中央、次端或顶端,为梭菌典型形态。

6.5 过氧化氢酶试验 加一滴3%过氧化氢溶液至琼脂表面的单个分散的菌落,或转移至载玻片上的菌落上。有气泡形成表示过氧化氢酶反应阳性,梭菌应成阴性结果。可用枯草芽孢杆菌作为阳性反应对照菌。

7 结果判断

若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌,有或无卵圆形或球形的芽孢。过氧化氢酶试验阴性,判供试品检出梭菌,否则判供试品未检出梭菌。

8 注意事项

8.1 操作时勿损伤皮肤,若有损伤,应立即注射破伤风抗毒素,以防感染。

8.2 凡带有活菌及毒素的器具,应在彻底灭菌后方可洗涤。


(七)白色念珠菌

1 简述

白色念珠菌(Candida albicans)又名白假丝酵母菌(Saccharomyces albicaus)属假丝酵母菌属(Saccharomyces)。白色念珠茵是条件致病菌,是医学全身性真菌感染病的重要组成之一,一旦感染,常可引起心内膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口疮、阴道炎、脑膜炎及败血症等。

白色念珠菌菌细胞呈圆形或卵圆形,直径为3~6um,革兰染色为阳性,但菌体着色不均匀,以出芽方式繁殖,在适宜的培养基上有芽生孢子及假菌丝生长,在假菌丝间其末端形成厚膜孢子。白色念珠菌具有β-硝基半乳糖苷酶,可分解NGL,使对一硝基苯酚游离,在碱性条件下显色。

白色念珠菌广泛分布于土壤、水和空气中,目前国内外的药品、食品标准已把白色念珠菌作为微生物检验中酵母菌的代表菌,因此有些药品依据给药途径和剂型将白色念珠菌作为控制菌是非常必要的。

2 试验器材及条件

2.1 设备及器皿

生化培养箱(23~28℃)、恒温培养箱(30~35℃)、水浴锅、显微镜、三角烧瓶、吸管、培养皿等。

2.2 标准菌株

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]。

菌液制备 取新鲜白色念珠菌菌种接种至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中,30~35℃培养24~48小时,用0.9%无菌生理盐水稀释至含菌10~100cfu/ml。菌液可用沙氏葡萄糖琼脂培养基平板计数测定。

2.3 培养基

沙氏葡萄糖液体培养基(附件二5.35)

沙氏葡萄糖琼脂培养基(附件二5.36)

念珠菌显色培养基(法国CHROMAGAR公司)[附件二5.37]

1%聚山梨酯80-玉米粉琼脂培养基(附件二5.38)

3 试验操作

取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)直接或处理后接种至适量(不少于100m1)的沙氏葡萄糖肉汤培养基中,培养24~48 h。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上,经30~35℃,培养24~48h(必要时延长至72h)。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大,颜色变深、质地变硬或有皱摺。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出白色念珠菌。

如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上,经30~35℃培养24~48h(必要时延长至72h)。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长,判供试品未检出白色念珠菌。

4 确认试验

若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色,挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上,培养24~48h。取培养物进行染色,镜检及芽管试验。

芽管试验 挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物,接种于加有一滴血清的载玻片上,盖上盖玻片,置湿润的平皿内,置35~37℃培养1~3h,置显微镜下观察,可见到由孢子长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰阳性菌,显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管,判供试品未检出白色念珠菌。



三、培养基适用性检查

1 概述

培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素,控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异,从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异,影响结果判断的客观性。

培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较,以阳性菌的生长状态或特征来评价判断检验用培养基是否符合检验要求。

微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。2010版《中国药典》微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。

2 培养基适用性检查实验的一般要求

2.1 培养基适用性检查适用范围

2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

培养基适用性检查试验可用于确定实验室所使用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基所用不同批次的原材料等)、制备程序(包括水质控制、配制方法、灭菌程序等)、保存条件(温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等)等是否满足微生物限度检查用要求。即上述影响培养基质量的各关键点应通过培养基适用性检查试验确定,如果其中有任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。但是影响培养基质量的关键控制点的变化应掌握在微生物实验室质量控制的一般原则内(见2.2),超过一般原则的培养基是否还能满足微生物限度检查用,无法通过培养基适用性检查确定。

当检验结果出现异常,或实验室质量控制需要,也可通过培养基适用性检查提供一定依据。

总之,培养基适用性检查是在正常条件下关于培养基质量的实验室控制措施,并不一定在每次具体的微生物限度检查样品检测试验活动中都必须同时进行培养基适用性检查试验,但每次微生物检查所用培养基均应经过适用性检查。

2.2 微生物限度检查用培养基质量控制的一般原则

2.2.1 不同处方培养基的替代使用不能通过培养基适用性试验简单确定。

2.2.2 培养基适用性检查不能取代供应商或其他法定标准对培养基的有效期、保存条件、制备方法等的更严格的规定。

2.2.3 如果没有特殊规定,培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可,但应采用一定措施加以检测控制,如蒸馏水应核实pH是否为5~7;采用离子交换法制备的纯化水,电阻值应不小于2MΩ等。

2.2.4 尽量临用现配。培养基灭菌后在能取出的前提下,尽快取出,切忌在高压锅内过夜存留;固体培养基灭菌或融化后,融化状态放置不得超过8h;一般预制培养基可置洁净环境2~25℃保存,但不应超过21天;固体琼脂培养基熔化再使用应不超过一次。

2.2.5 干粉培养基或培养基原料变质不应再用;预制培养基储存过程中发现浑浊、变色、长菌、严重脱水等变化不应再用。

2.3 对照培养基

对照培养基应通过严格的质量研究和控制,具备性能稳定、质量优异的特点。对照培养基作为一种标准试剂,应具备可靠的来源和质量保障。

2.4 培养基适用性检查指标及常用方法

2.4.1 检查指标:促生长能力、指示能力、抑制能力。

2.4.2 常用方法:直接接种法、浇碟法、表面接种法(涂布法)。

2.4.3 液体培养基通常采用直接接种法测定上述3种指标,接种时应注意接种量不得超过培养基体积的10%。固体培养基采用浇碟法和表面接种法测定上述指标。采用浇碟法考察固体培养基时,为了保证取样的平行性,平行测定两皿求平均数;采用表面接种法(涂布法)考察固体培养基时,表面接种菌液不多于0.2ml/皿,尽量控制在0.1ml/皿,保证取样间的平行性,平行测定两皿观察结果。

3 计数培养基的适用性检查

微生物限度检查中计数用培养基有3种,营养琼脂、玫瑰红钠琼脂和酵母浸出粉葡萄糖琼脂。

3.1 计数培养基适用性检查试验用菌株

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501]

白色念珠茵(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]

黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98003]

菌株的培养及菌液制备同微生物限度检查方法验证。

3.2 实验操作

3.2.1 培养基制备按规定程序新鲜配制营养琼脂(被检培养基和对照培养基)、玫瑰红钠琼脂(被检培养基和对照培养基)以及酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(被检培养基和对照培养基),灭菌后备用。

3.2.2 营养琼脂培养基取7个无菌平皿,分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各2皿,每皿接种1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平皿不接种菌作为空白对照,倾注对照营养琼脂培养基,混匀,凝固后于30~35℃倒置培养48h,计数;被检培养基同法操作。

3.2.3 玫瑰红钠琼脂培养基取5个无菌平皿,分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各2皿;每皿接种1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平皿不接种菌作为空白对照,倾注对照玫瑰红钠琼脂培养基,混匀,凝固后于倒置培养72h,计数;被检培养基同法操作。

3.2.4 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基取3个无菌平皿,分别接种白色念珠菌2皿,每皿接种1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平皿不接种菌作为空白对照,倾注对照酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固后倒置培养72h,计数;被检培养基同法操作。

3.3 结果判断

若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致,则判断该培养基的适用性检查符合规定。

4 控制菌检查用培养基适用性检查

控制菌检查用成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。

4.1 计数培养基适用性检查试验用菌株

大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102]

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]

乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]

菌株的培养及菌液制备同微生物限度检查方法验证。

4.2 各种培养基需要测试的能力及判断指标

液体培养基促生长能力检查:取不大于100cfu的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度(30~35℃)及最短培养基时间下培养。增菌培养基多为澄清液体培养基,与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变浑浊。

固体培养基促生长能力检查:取试验菌液0.1ml(含菌数50~100cfu)分别涂布于被检培养基和对照培养基上,在相应控制菌检查规定的培养温度(30~35℃)及最短培养基时间下培养。

与对照培养基比较,被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

液体培养基指示能力检查:取不大于100cfu的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度(30~35℃)及最短培养基时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基中试验菌应生长情况/指示剂反应等应与对照培养基一致。

固体养基指示能力检查:取试验菌液0.1ml(含菌不大于100cfu)分别涂布于被检培养基和对照培养基上,在相应控制菌检查规定的培养温度(30~35℃)及培养基时间下培养。被检培养基上试验菌的茵落形态特征、菌落颜色及指示剂反应情况应与对照培养基一致。

培养基抑制能力检查:取不大于100cfu的试验菌分别接种于液体被检培养基和对照培养基,取试验菌0.1ml液(不大于100cfu)分别涂布于固体被检培养基和对照培养基,在相应控制菌检查规定的培养温度(30~35℃)及最长培养基时间下培养,试验菌应不得生长。

4.3 控制菌检查用培养基能力测试列表(表7)

控制菌检查涉及的21种培养基,特点各异。表格中概述培养基检查的具体项目,具体操作程序在其后说明。

表7 控制菌检查用培养基适用性检查项目、菌株及判断指标

培养基

测试菌株

测试特性

测试指标

胆盐乳糖培养基

大肠埃希菌

促生长能力

浑浊

铜绿假单胞菌

浑浊

金黄色葡萄球菌

抑制能力

未见浑浊

MUG培养基

大肠埃希菌

促生长能力

浑浊

大肠埃希菌

指示能力

366nm有荧光

曙红亚甲蓝琼脂

或麦康凯琼脂

大肠埃希菌

促生长能力

回收率

乙型副伤寒沙门菌

回收率

大肠埃希菌

指示能力

颜色形态同对照

乙型副伤寒沙门菌

颜色形态同对照

乳糖胆盐发酵管

大肠埃希菌

促生长能力

浑浊产气

金黄色葡萄球菌

抑制能力

未见浑浊

乳糖发酵培养基

大肠埃希菌

促生长能力

浑浊

大肠埃希菌

指示能力

产气

营养肉汤

乙型副伤寒沙门菌

促生长能力

浑浊

金黄色葡萄球菌

促生长能力

浑浊

四硫磺酸钠亮绿培养基

乙型副伤寒沙门菌

促生长能力

上清浑浊

金黄色葡萄球菌

抑制能力

上清未见浑浊

胆盐硫乳琼脂

或沙门、志贺属琼脂

乙型副伤寒沙门菌

促生长能力

回收率

乙型副伤寒沙门菌

指示能力

颜色形态同对照

溴化十六烷基三甲铵

琼脂

铜绿假单胞菌

促生长能力

回收率

大肠埃希菌

抑制能力

不得生长

绿脓菌素测定用培养基

铜绿假单胞菌

促生长能力

回收率

铜绿假单胞菌

指示能力

颜色形态同对照

亚碲酸盐肉汤培养基

金黄色葡萄球菌

促生长能力

浑浊

大肠埃希菌

抑制能力

未见浑浊

卵黄氯化钠琼脂或

甘露醇氯化钠琼脂

金黄色葡萄球菌

促生长能力

回收率

金黄色葡萄球菌

指示能力

颜色形态同对照

大肠埃希菌

抑制能力

不得生长


培养基

测试菌株

测试特性

测试指标

梭菌增菌培养基

生孢梭菌

促生长能力

浑浊

哥伦比亚琼脂

生孢梭菌

促生长能力

回收率

沙氏葡萄糖肉汤

白色念珠菌

促生长能力

浑浊

沙氏葡萄糖琼脂

白色念珠菌

促生长能力

回收率

白色念珠菌

指示能力

颜色形态同对照

念珠菌显色培养基

白色念珠菌

促生长能力

回收率

白色念珠菌

指示能力

颜色形态同对照

白色念珠菌

抑制能力

不得生长

1%聚山梨醋80-玉米

琼脂培养物

白色念珠菌

促生长能力

回收率

白色念珠菌

指示能力

颜色形态同对照


4.4 各控制菌检查用培养基适用性检查实验操作

控制菌检查用培养基数量较多,特点各不相同。为了避免培养基配制过程出现遗漏,此处特别提示以下几个需要特殊注意到培养基:

不可高压灭菌只能加热煮沸灭菌的培养基3种:DHL琼脂、SS琼脂和念珠菌显色培养基;

需要添加试剂的培养基3种:TTB培养基、亚碲酸盐肉汤和哥伦比亚琼脂培养基。

以下叙述各培养基适用性检查的具体操作过程:

4.4.1 胆盐乳糖培养基 新鲜配制100ml/瓶的对照胆盐乳糖培养基4瓶,121℃灭菌15min。备用。分别接种大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌各1瓶,接种菌液量1ml(不大于100cfu),另一瓶不接种菌作为空白对照;被检培养基同法操作,置规定温度培养。培养18小时,与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变浑浊;培养48小时,空白培养瓶和接种金黄色葡萄球菌的培养瓶应不得浑浊;

4.4.2 MUG培养基新鲜配制5ml/支的对照MUG培养基,121℃灭菌15min,备用。取3支,接种大肠埃希菌2支,接种菌液0.2ml(不大于100cfu),另一支不接种菌作为空白对照,培养5小时。在366nm紫外光灯下观察结果;被检培养基同法操作,置规定温度培养。空白培养管应不得浑浊,且366nm处观察无荧光;与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变浑浊,366nm处应呈现荧光。若荧光不明显,则可延长至24h观察。

4.4.3 曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB) 新鲜配制对照EMB琼脂培养基,121℃灭菌15min,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取5个无菌EMB琼脂平板,分别涂布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养18h,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养24h,空白平板应无菌落生长。

4.4.4 麦康凯琼脂培养基 新鲜配制对照麦康凯琼脂培养基,121℃灭菌15min,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取5个无菌麦康凯琼脂平板,分别涂布接种大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌各5皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养18小时,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养24小时,空白平板应无菌落生长。

4.4.5 乳糖胆盐发酵培养基 新鲜配制10m/支的对照胆盐乳糖培养基,121℃灭菌15min,备用。取5支,分别接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌,各2支,接种菌液1ml(不大于100cfu),另一支不接种菌作为空白对照;被检培养基同法操作,置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变色、浑浊,且倒管中应有明显的产气现象;培养24h,空白培养管和接种金黄色葡萄球菌的培养管应不得变色、不得浑浊。

4.4.6 乳糖发酵培养基 新鲜配制10ml/支的对照乳糖发酵培养基,121℃灭菌15min,备用。取3支,接种大肠埃希菌2支,接种菌液1ml(不大于100cfu),另一支不接种菌作为空白对照;被检培养基同法操作,置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较.被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变色、浑浊,且有导管中应有明显的产气现象;培养24h,空白培养管应不得变色、不得浑浊。

4.4.7 营养肉汤培养基 新鲜配制100ml/瓶的对照营养肉汤培养基3瓶,121℃灭菌15min,备用。分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌各1瓶,接种菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接种菌株作为空白对照;被检培养基同法操作,置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变浑浊;培养48h,空白培养瓶应不得浑浊。

4.4.8 四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB) 新鲜配制10ml/支的对照TTB培养基基础,121℃灭菌15min,备用。临用前,无菌操作加入0.2ml碘试液和0.lml亮绿试液。取5支,分别接种乙型副伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌各2支,接种菌液1ml(不大于100cfu),另一支不接种菌作为空白对照;被检培养基同法操作,置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基上清浑浊;培养24h,空白的培养管和接种金黄色葡萄球菌的培养管应不得浑浊。

由于TTB中的碳酸钙对浑浊现象观察有影响,因此若浑浊现象不明显,则将各培养物接种至胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门、志贺属琼脂(SS)平板上划线观察TTB培养物生长情况,空白对照和接种金黄色葡萄球菌的培养管划线后应无菌落生长,对照和被检TTB培养基划线接种至琼脂平板后应有菌落生长,且颜色形态一致。

4.4.9 胆盐硫乳琼脂培养基(DHL) 新鲜配制对照DHL琼脂培养基,加热充分溶解,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取3个无菌DHL琼脂平板,涂布接种乙型副伤寒沙门菌2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养18h,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养48h,空白平板应无菌落生长。

4.4.10 沙门、志贺属琼脂培养基(SS) 新鲜配制对照SS琼脂培养基,加热充分溶解,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取3个无菌SS琼脂平板,涂布接种乙型副伤寒沙门菌2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养18h,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养48h,空白平板应无菌落生长。

4.4.11 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基础 新鲜配制对照溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基,121℃灭菌15min,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取7个无菌琼脂平板,分别涂布接种铜绿假单胞菌和大肠埃希菌各3皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养18h,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养24h,空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。

4.4.12 绿脓菌素测定用培养基(PDP) 新鲜配制对照绿脓菌素测定用培养基基础,每升培养基中加入10ml甘油,121℃灭菌15min,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取3个无菌绿脓菌素测定用琼脂平板,涂布接种铜绿假单胞菌2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养24h;被检培养基同法操作。空白平板应无菌落生长,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致。

4.4.13 亚碲酸盐肉汤培养基 新鲜配制100ml/瓶的对照营养肉汤培养基3瓶,121℃灭菌15min,备用。临用加入新鲜配制的无菌1%亚碲酸盐0.2ml。分别接种金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌各1瓶,接种菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接种菌株作为空白对照;被检培养基同法操作,置规定温度培养。培养18h,与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变黑、变浑浊;培养48h,空白培养瓶和接种大肠埃希菌的培养瓶应不得浑浊。

4.4.14 卵黄氯化钠琼脂培养基新鲜配制对照卵黄氯化钠琼脂培养基基础,121℃灭菌15min,冷却至60℃,参照2010版《中国药典》比例无菌操作加入10%氯化钠卵黄液,充分振摇后倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取5个无菌琼脂平板,分别涂布接种金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌各2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养24h,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养72h,空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。

4.4.15 甘露醇氯化钠琼脂培养基 新鲜配制对照甘露醇氯化钠琼脂培养基,121℃灭菌15min,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取5个无菌琼脂平板,分别涂布接种金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌各2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~1000fu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养24小时,被检培养基菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养72h,空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。

4.4.16 梭菌增菌培养基 新鲜配制100ml/瓶的对照梭菌增菌培养基2瓶,121℃灭菌15min,备用。接种生孢梭菌1瓶,接种菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接种菌株作为空白对照,置规定温度的厌氧条件培养48h;被检培养基同法操作。空白培养瓶应不得浑浊;与对照培养基比较,被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变浑浊。

4.4.17 哥伦比亚琼脂培养基 新鲜配制对照哥伦比亚琼脂培养基,121℃灭菌15min,冷却至60℃后倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取3个哥伦比亚琼脂平板,涂布接种生孢梭菌2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后置规定温度的厌氧条件下倒置培养;被检培养基同法操作。48小时空白平板应无菌落生长,被检培养基菌落大小、形态特征应与对照培养基上的菌落一致。

哥伦比亚琼脂培养基营养丰富,适宜多数需氧菌的生长,为了消除其它杂菌生长对检查结果的影响,可在每升灭菌后培养基中按无菌操作添加含有相当于20mg庆大霉素的硫酸庆大霉素。添加庆大霉素的哥伦比亚琼脂可参照上述方法进行培养基适用性考察。

4.4.18 沙氏葡萄糖肉汤培养基 新鲜配制100ml/瓶的对照沙氏葡萄糖肉汤培养基2瓶,121℃灭菌15min,备用。接种白色念珠菌1瓶,接种菌液1ml(不大于100cfu),另一瓶不接种菌株作为空白对照;被检培养基同法操作,置规定温度培养。培养48h,与对照培养基比较。被检培养基中试验菌应生长良好,表现为液体培养基变浑浊;培养72h,空白培养瓶应不得浑浊。

4.4.19 沙氏葡萄糖琼脂培养基 新鲜配制对照沙氏葡萄糖琼脂培养基,121℃灭菌15min,冷却至60℃后,倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取3个沙氏葡萄糖琼脂平板,涂布接种白色念珠菌2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养24h,被检培养基上的菌落大小、形态特征、颜色及气味应与对照培养基上的菌落一致;培养72h,空白平板应无菌落生长。

4.4.20 念珠菌显色培养基 新鲜配制对照念珠菌显色培养基,加热充分溶解,冷却至60℃倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。念珠菌显色平板使用前避光保存,取5个无菌念珠菌显色平板,分别涂布接种白色念珠菌和大肠埃希菌各2皿,接种0.1ml菌液(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养24h,被检培养基上的菌落大小、形态特征及颜色应与对照培养基上的菌落一致;培养72h,空白平板和接种大肠埃希菌的平板应无菌落生长。

4.4.21 1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基 新鲜配制对照1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基基础,每升培养基中加入10ml聚山梨酯80,121℃灭菌15min,冷却至60℃后,倾注平皿,35℃培养箱预培8h后备用。取3个1%聚山梨酯80-玉米琼脂平板,涂布接种白色念珠菌2皿,接种菌液0.1ml(含菌50~100cfu),另一平板不接种菌作为空白对照,涂布均匀后于规定温度倒置培养;被检培养基同法操作。培养24h,被检培养基菌落的大小、形态特征及芽管指示能力应于与对照培养基上的菌落一致;培养48h,空白平板应无菌落生长。

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