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PCR实验室规范化管理

文章来源:http://www.iwuchen.com/  2020年05月26日  点击数:691

分子生物学检验--最具挑战性的专业


是临床检验发展最快的专业

将是应用最广的专业

方兴未艾的专业

将是最具活力的专业




医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则


一、临床基因扩增检验实验室的设计

(一)临床基因扩增检验实验室区域设计原则

(二)临床基因扩增检验实验室的空气流向

(三)工作区域仪器设备配置标准。


二、临床基因扩增检验实验室工作基本原则


三、临床基因扩增检验实验室各区域工作注意事项


临床分子检验实验室日常管理的关键点


关键点一、防污染意识和措施

PCR技术最令人头痛的问题是污染,极其微量的污染即可造成假阳性的结果。如果形成气溶胶污染扩散,则可引起整个PCR实验室的污染,处理起来非常棘手,甚至要关闭实验室。


严格执行各区功能划分

1.试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

2.标本制备区:核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。

3.扩增区:cDNA合成、DNA扩增及检测。

4.扩增产物分析区:扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。


● 物:特别是要承担部分科研工作的实验室

● 人:操作者、科主任、实习进修生、保洁员、患者(家属)……

● 工作流程:单一流向

● 操作规程:认真对待每一个细节


进入各工作区域应当严格按照单一方向进行,即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。

各工作区域必须有明确的标记,不同工作区域内的设备、物品不得混用

不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开各工作区域时,不得将工作服带出。

实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染

工作结束后,必须立即对工作区进行清洁(次氯酸钠)。实验台表面的紫外照射应当方便有效(可移动紫外灯,254nm波长),在工作完成后调至实验台上60~90cm内照射。

实验室的安全工作制度或安全标准操作程序,所有操作符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。


注意事项:

试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在试剂储存和准备区 ,应当保存在标本处理区。

由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染,可通过在标本制备区内设立正压条件,避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,必须盖好含反应混合液的反应管。

必须注意的是,所有经过检测的反应管不得在扩增区打开。

必须注意避免通过扩增产物分析区的物品及工作服将扩增产物带出。


不规范操作案例:

阳性对照和标准品与试剂混放


关键点二、记录(内容、形式、保存) 

1.试剂:出入库、质检、使用记录、自配试剂、高压消毒器械、结论、署名

2.仪器:(电子天平、低温冷冻高速离心机、水浴锅、移液器、离心机、超净台、混匀器等)使用情况记录、运行状况、结论(含校准、维护保养、维修记录,原始数据后附清单)

3.基本条件状况:温湿度、冰箱冷藏冷冻温度(绘图)、紫外灯照射累积时间(含超净台、传递窗和空气消毒灯)、可移动紫外灯照射累积时间及照射范围、结论、署名

4.标本:验收(含标本性状)、拒收及理由、特送标本双签字

5.质控(购买或自备、绘图时 X、SD、CV)

6. 实验过程记录单/表:(见下方图1、图2)

7.报告:具体方法学(实时荧光定量/定性PCR)、标本类型及性状说明、唯一编号、阴阳性及定量、参考范围/最低检测限的确定、送检时间(具体到时)、报告时间(具体到分)、备注(结果仅对此标本负责。如有疑问,请于一周内到PCR实验室查询!)

8.抱怨记录:应有时间、事件(项目)、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认。


不规范操作案例:



工作记录与相关制度不一致↓


关键点三、质量控制

SOP文件的现行有效性

仪器的标识维护保养

试剂及耗品的质检

.室内质控


1.管理文件部分:

工作制度

各种管理程序文件

各项工作程序及流程、标准操作程序( SOP)

各种表格(Tab-1……)


注意事项:

操作人员必须熟悉掌握本实验室各项工作制度及SOP文件。当新版文件核准使用后,应将原文件及时收回。


一定做到:

写你所做的

做你所写的

记你所做的

分析所记的

改你分析的


2.关于标识:

实验室名称

各区名称

入口出口说明

禁入标识

单向说明及箭头

生物防护标识

生物防护垃圾袋

仪器运行绿色标签【注意:a.要比较明显的被看见、先考虑显而易见、再考虑美观  b.绿:正常运行、黄:暂停、红:停用】

重要仪器校验和档案标签

记录笔、纸、抹布、加样器、枪头盒等办公用品各区不同颜色标识标签

柜、凳标识

可移动仪器标识

(可以)总的和各区的规章制度上墙、上门,重要仪器的操作流程卡上墙



关键点四、档案管理

1.仪器档案

主要仪器应有:

(a)放置地点;

(b)制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识;

(c)仪器使用说明书或其复印件;

(d)校准/检测的日期和结果以及下次校准和/或检测的日期;

(e)迄今所进行的维护和今后维护计划的细节;

(f)损坏、故障、改装或修理的历史。


加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件及复印件【可每品种有一套具备计量局的校正报告,并以此作为其它加样器、温湿度计的校正标准】【加样器要有出厂编号、使用时间、校正记录】

扩增仪需有仪器厂家提供进口医疗器械销售使用许可证,安装服务单、装机单,仪器说明书及复印件,专业技术人员维护校正报告和校正后参数,仪器维护后验证记录【用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值】

高速低温冷冻离心机需出具计量局校正报告文件【转速、温度,校准、拟下次校准】


2.试剂档案

医疗药品生产许可证明,PCR试剂新药证书,PCR试剂生产许可证,PCR试剂使用说明书,试剂厂商或销售商的销售许可证。【应有厂家或厂家授权销售商的红色印章】


3.人员和技术档案

实验室主要负责人、实验室技术人员名单

简历表、培训档案,要求有实质性文件【如每人的学历证书及复印件、操作上岗证、科研成果(课题)、技术文章、获奖证书等的复印件。】

根据实际情况及时进行增补。


关键点五、学习培训

基础知识:如何设定阈值线?如何调整标准曲线?

专业新进展

报告结果的解释

正确对待临床和患者等方面的抱怨


关键点六、其他

报告单的审核与签发:编号唯一性、项目完整性、书写完整性

操作者和审核者有无PCR上岗资质?

检测结果的单位:

参考值/最低检测限:定量报告

……


作者:冯忠军

单位:河北医科大学第三医院检验科

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